ПРИЛОГ 1.

БРЗИ ТЕСТОВИ

1. Брзи тестови за мониторинг БСЕ код говеда су:

1) имуноблотинг заснован на поступку Western bloting за откривање фрагмента PrPRes отпорног на протеиназу K (test Prionics-Check Western);

2) сендвич-метода имунолошког одређивања PrPRes (протокол краткога имунолошког одређивања – SAP) која се обавља после денатурације и концентрације (брзи тест Bio-Rad TeSeE);

3) имунолошко одређивање на бази микроплоча (ELISA) којим се открива PrPRes отпоран на протеиназу K сa моноклонским антителима (Prionics-Check LIA test);

4) имунолошко одређивање које се заснива на селективном везивању PrPSc на хемијски полимер и детекцији моноклонских антитела усмерених према очуваним деловима молекула PrP (IDEXX HerdChek BSE Antigen Test Kit, EIA & HerdChek BSE-Scrapie Antigen (IDEXX Laboratories));

5) „lateral flow” имунолошко одређивање уз употребу два различита моноклонска антитела за откривање фрагмената PrP отпорних на протеиназу K (Prionics Check PrioSTRIP);

6) двострано имунолошко одређивање уз употребу два различита моноклонска антитела усмерена ка два епитопа који су присутни у врло развијеном облику говеђег PrPSc (Roboscreen Beta Prion BSE EIA Test Kit).

2. Брзи тестови за мониторинг ТСЕ код оваца и коза су:

1) сендвич-метода имунолошког одређивања PrPRes (протокол краткога имунолошког одређивања – SAP) која се обавља после денатурације и концентрације (брзи тест Bio-Rad TeSeE);

2) сендвич метода имунолошког одређивања за PrPRes помоћу комплета TeSeE Sheep/Goat Detection kit, спроведена после поступка денатуризације и концентрације помоћу комплета TeSeE Sheep/Goat Purification kit (брзи тест Bio-Rad Te-SeE Sheep/Goat);

3) имунолошко одређивање које се заснива на селективном везивању PrPSc на хемијски полимер и детекцији моноклонских антитела усмерених према очуваним деловима молекула PrP (HerdChek BSE-Scrapie Antigen (IDEXX Laboratories)),

3. Код свих брзих тестова узорак ткива који се користи за тестирање мора да буде у складу са упутствима произвођача.

ПРИЛОГ 2.

МЕТОДЕ АНАЛИЗЕ ЗА ОДРЕЂИВАЊЕ САСТОЈАКА ЖИВОТИЊСКОГ ПОРЕКЛА ЗА СЛУЖБЕНУ КОНТРОЛУ ХРАНЕ ЗА ЖИВОТИЊЕ

1. ЦИЉ И ПОДРУЧЈЕ ПРИМЕНЕ

Одређивање састојака животињског порекла у храни за животиње спроводи се светлосном микроскопијом или ланчаном реакцијом полимеразe (PCR) у складу са наводима из овог прилога.

Ове две методе омогућују откривање присуства састојака животињског порекла у хранивима, предсмешама и смешама за исхрану животиња. Међутим, оне не омогућавају израчунавање количине таквих састојака у хранивима и смешама. Обе методе имају границу детекције испод 0,1% (m/m).

PCR метода омогућује одређивање таксономске групе састојака животињског порекла присутних у хранивима, предсмешама и смешама за исхрану животиња.

Ове методе примењују се при контроли и одређивању присуства састојака животињског порекла у храни за животиње.

У зависности од врсте хране за животиње која се испитује, ове методе могу да се користе у оквиру једног јединственог оперативног протокола било самостално или заједно у складу са стандардним оперативним процедурама (СОП) које је успоставила референтна лабораторија ЕУ за протеине животињског порекла у храни за животиње (ЕУРЛ-АП) и објавила на својој интернет страници.1

2. МЕТОДЕ

2.1. Светлосна микроскопија

2.1.1. Начело

Састојци животињског порекла, који могу да буду присутни у хранивима и смешама за исхрану животиња послатих на анализу, идентификују се на основу типичних и микроскопски препознатљивих карактеристика као што су мишићна влакна и остали делови меса, хрскавица, кости, рогови, длака, чекиње, кутикуларни фрагменти бескичмењака, трахеалне структуре инсеката, крв, перје, љуске јаја, капљице млека, кристали лактозе, рибље кости и крљушти.

Микроскопска испитивања спроводе се после припреме узорака седиментацијом.

Узорци се подвргавају поступку седиментације на следећи начин:

1) за детекцију састојака животињског порекла осим од копнених бескичмењака, поступак једноструке седиментације тетрахлоретиленом како је наведено у тачки 2.1.3.4.3;

––––––––

1 1 https://www.eurl.craw.eu/legal-sources-and-sops/method-of-reference-and-sops/

2) за детекцију састојака копнених бескичмењака, поступак двоструке седиментације петролетером/тетрахлоретиленом (ПЕ/ТЦЕ), како је наведено у тачки 2.1.3.4.4.

2.1.2. Реагенси и опрема

2.1.2.1. Реагенси

2.1.2.1.1. Средство за концентровање

2.1.2.1.1.1. Тетрахлоретилен (густина 1,62);

2.1.2.1.1.2. Петрол eтaр (ПE) тачке кључања 40–60 °C (специфична тежина 0,65)

2.1.2.1.2. Реагенс за бојење

2.1.2.1.2.1. Ализарин црвена (раствори се 2,5 ml 1М хлороводоничне киселине у 100 ml воде и том раствору се дода 200 mg ализарин црвене);

2.1.2.1.3. Средства за припрему препарата

2.1.2.1.3.1. База (NaOH 2,5% w/v или КОH 2,5% w/v),

2.1.2.1.3.2. Глицерол (неразређен, вискозност: 1 490 cP), или средство за припрему препарата са еквивалентним својствима за припрему привремених препарата;

2.1.2.1.3.3. Norland® Optical Adhesive 65 (вискозност: 1 200 cP) или смола са истоветним својствима за припрему трајних препарата;

2.1.2.1.4. Средства за припрему препарата са особинама бојења

2.1.2.1.4.1. Луголов раствор (раствори се 2 g калијум-јодида у 100 ml воде, затим се уз често мућкање дода 1 g јода),

2.1.2.1.4.2. Цистински реагенс (2 g оловног ацетата, 10 g NaOH/100 ml воде),

2.1.2.1.4.3. Фехлингов реагенс (припрeми се прe употребе од једнаких делова (1/1) основних раствора А и Б. Раствор А: 6,9 бакар (II) сулфат пентахидрата раствори се у 100 ml воде. Раствор Б: 34,6 g калијум-натријум тартарат тетрахидрата и 12 g NaOH раствори се у 100 ml воде),

2.1.2.1.4.4. Тетраметилбензидин/водоник пероксид (раствори се 1 g 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) у 100 ml ледене сирћетне киселине и 150 ml воде. Пре употребе помеша се са раствором тетраметилбензидин са 3% водоник пероксидом у размери 4:1);

2.1.2.1.5. Средства за испирање

2.1.2.1.5.1. Етанол ≥ 96% (технички чист),

2.1.2.1.5.2. Ацетон (технички чист);

2.1.2.1.6. Реагенс за избељивање

2.1.2.1.6.1. Комерцијални раствор натријум хипохлорита (9–14% активног хлора);

2.1.2.2. Опрема

2.1.2.2.1. Аналитичка вага с прецизношћу од 0,001 g,

2.1.2.2.2. Прибор за млевење: нож или млин са ротором. Ако се користи млин са ротором забрањена је употреба млинских сита ≤ 0,5 mm.

2.1.2.2.3. Сито са мрежицом квадратних отвора ширине 0,25 mm и 1 mm. Осим код претходног просејавања узорка, величина сита не сме бити већа од 10 cm како би се избегао губитак материјала. Калибрација сита није потребна.

2.1.2.2.4. Конусни стаклени левак за одвајање запремине 250 ml са тефлонским чепом или чепом од брушеног стакла на дну конуса. Промер отвора чепа мора бити ≥ 4 mm. Уместо тога, само за једноструку седиментацију тетрахлоретиленом може употребити чаша са конусним дном за таложење под условом да је лабораторија доказала да су границе детекције истоветне онима када се користи конусни стаклени левак за одвајање;

2.1.2.2.5. Стереомикроскоп који обухвата барем коначни опсег повећања од 6,5 × до 40 ×;

2.1.2.2.6. Светлосни микроскоп који обухвата барем коначни опсег повећања од 100 × до 400 × са пољем за пропуштено светло. Могу се додатно користити поларизовано светло и диференцијални интерферентни контраст;

2.1.2.2.7. Стандардно лабораторијско посуђе од стакла;

2.1.2.2.8. Опрема за припрему препарата: класичне микроскопске плочице, плочице са удубљењем, покровна стакалца (20 × 20 mm), пинцета, фина лопатица (шпатула);

2.1.2.2.9. Лабораторијска пећ;

2.1.2.2.10. Центрифуга;

2.1.2.2.11. Филтер папир: квалитативни целулозни филтрат (величине пора 4-11 µm)

2.1.3. Узорковање и припрема узорка

2.1.3.1. Узорковање

Користи се репрезентативан узорак који је узет у складу са одељком из овог прилога: Методе узорковања;

2.1.3.1.1. Сушење узорка: узорци са садржајем влаге > 14% морају се осушити пре руковања;

2.1.3.1.2. Претходно просејавање узорка: Како би се прикупиле информације о могућем загађењу из околине, препоручује се да се храна у пелетима и зрну претходно просеје на 1 mm, затим се добиjeнe фракције анализирају као одвојени узорци и о њима се одвојено издаје извештај;

2.1.3.2. Мере предострожности

Како би се спречила унакрсна контаминација у лабораторији, сву лабораторијску опрему за вишекратну употребу потребно је пажљиво очистити пре употребе. Делове левка за одвајање потребно је пре чишћења раставити. Делове левка за одвајање и посуђе од стакла потребно је претходно опрати ручно, а затим опрати у машини за суђе. Сита се морају очистити четком са тврдим синтетичким длачицама. Препоручује се завршно чишћење сита ацетоном и компримованим ваздухом након просејавања масног материјала, као што је рибље брашно.

2.1.3.3. Припрема узорака који се састоје од масти или уља

Потребно је пратити следећи протокол за припрему узорака који се састоје од масти:

1) ако је маст у чврстом стању, загрева се у пећници, док не постане течна,

2) користећи пипету пренесе се 40 ml масти или уља са дна узорка у епрувету за центрифугирање,

3) центрифугира се 10 минута на 4 000 окр./мин.,

4) ако је маст очврснула posle центрифугирања, загрева се у пећi док не постане течна,

5) поново се центрифугира 5 минута на 4 000 окр./мин.,

6) кашичицом или лопатицом се пренесе половина декантоване нечистоће на микроскопску плочицу за идентификацију. Као средство за припрему препарата препоручује се глицерол,

7) преостала нечистоћа користи се за припрему талога како је описано у тачки 2.1.3.4.3.

Исти поступак, осим тачке 1) и тачке 4), примењује се за припрему узорака који се састоје од уља.

2.1.3.4. Припрема узорака осим масти и уља

2.1.3.4.1. Дељење узорка у подузорке и млевење: најмање 50 g узорка се подели на подузорке за анализу, који се затим мељу.

2.1.3.4.2. Припрема сировине: припреми се део од најмање 5 g самлевеног подузорка. Просејава се на 0,25 mm и две добијене фракције се испитују.

2.1.3.4.3. Једнострука седиментација тетрахлоретиленом за детекцију састојака животињског порекла, осим копнених бескичмењака.

2.1.3.4.3.1. Екстракција и припрема талога: пренесе се део од 10 g (са прецизношћу од 0,01 g) самлевеног подузорка у левак за одвајање или чашу са конусним дном за таложење и дода се 50 ml тетрахлоретилена. Део који је пренесен у левак мора се ограничити на 3 g у случају рибљег брашна или других чистих производа животињског порекла, минералних састојака или предсмеша који производе више од 10% талога. Мешавину је потребно снажно протрести у трајању од најмање 30 секунди и мора се опрезно додати најмање још 50 ml тетрахлоретилена како би се испрале унутрашње површине левка и уклониле све пријањајуће честице. Тако добијена мешавина се остави да стоји најмање 5 минута пре одвајања талога отварањем чепа.

Ако се користи чаша с конусним дном за таложење, мешавину је потребно снажно мешати најмање 15 секунди, а све пријањајуће честице уз зидове чаше потребно је пажљиво испрати низ унутрашњу површину са најмање 10 ml чистог тетрахлоретилена. Мешавину је потребно оставити да стоји 3 минута и затим поново промешати у трајању од 15 секунди, а све честице које пријањају уз зидове чаше потребно је пажљиво испрати низ унутрашњу површину с најмање 10 ml чистог тетрахлоретилена. Тако добијена мешавина остави се да стоји најмање 5 минута, затим се течна фракција одстрани и уклони пажљивим декантовањем, водећи рачуна да се ни мало талога не изгуби.

Талог се прикупља на филтер папиру који се ставља у левак како би се омогућило одвајање преосталог тетрахлоретилена и притом избегло накупљање масти у талогу. Талог се затим суши.

Талог се затим измери (са прецизношћу од 0,001 g) у сврху контроле седиментације. Талог се затим просејава на 0,25 mm и две добијене фракције се испитују, осима ако се просејавање сматра непотребним.

2.1.3.4.3.2. Екстракција и припрема флотата: после добијања талога, у левку за одвајање морају остати две фазе: течна која се састоји од тетрахлоретилена и чврста која се састоји од пливајућег материјала. Та чврста фаза је флотат који се изолује тако што се тетрахлоретилен у целини одлије из левка отварањем чепа. Окретањем левка за одвајање, флотат се пренесе у велику Петријеву шољу и осуши се на ваздуху у дигестору. Просејава се на 0,25 mm и две добијене фракције се испитују;

2.1.3.4.3.3. Употреба реагенса за бојење

Како би се олакшала правилна идентификација састојака животињског порекла, аналитичар може да користи реагенсе за бојење у току припреме узорка у складу са смерницама које је издала ЕУРЛ-АП и објавила на својој интернет страници.

Ако се користи раствор Ализарин црвене за бојење талога, примењује се следећи протокол:

1) осушени талог се пренесе у стаклену епрувету и двапут испере с приближно 5 ml етанола (сваки пут се користи центрифуга у току 30 секунди, а раствор се остави да стоји приближно 1 минут и 30 секунди, па се затим одлије),

2) талог се избели додавањем најмање 1 ml натријум хипохлорита. Реакција се развија 10 минута. Епрувета се напуни водом, талог се остави да стоји 2–3 минута, а вода и суспендоване честице се пажљиво одлију,

3) талог се двапут испере са 10 ml воде (користи се вртложна мешалица (vortex) 30 секунди, остави се да се исталожи и сваки пут се одлије вода),

4) дода се 2–10 капи раствора Ализарин црвене и смеша се промућка у центрифуги. Трајање реакције је 30 секунди и обојени талог се двапут испере с приближно 5 ml етанола, затим једанпут ацетоном (сваки пут се користи центрифуга 30 секунди, а растварач се остави да стоји приближно 1 минут и затим одлије),

5) обојени талог се осуши.

2.1.3.4.4. Двострука седиментација петролетром/тетрахлоретиленом за детекцију састојака копнених бескичмењака.

Сви кораци се спроводе у конусном стакленом левку за одвајање запремнине 250 ml на начин из тачке 2.1.2.2.4.

2.1.3.4.4.1. Део од 10 g (са прецизношћу од 0,01 g) самлевеног узорка пренесе се у левак за одвајање и прво се подвргава једнострукој седиментацији тетрахлоретиленом како је описано у тачки 2.1.3.4.3., укључујући добијање талога на филтар папиру постављеном на левак. Тај се талог може употребити као талог из тaчке 2.1.3.4.3.

2.1.3.4.4.2. Мали волумен тетрахлоретиленa који се исцеди заједно са талогом преноси се у мензуру. Мензура се мора додатно напунити отварањем чепа левка за одвајање док се не добије 30 мл тетрахлоретилена. Кад се тај волумен достигне, левак се затвори.

2.1.3.4.4.3. Прикупљени волумен тетрахлоретиленa замењује се додавањем волумена од 30 мл петролетера тачке кључања 40–60 °C у левак за одвајање. Садржај левка за одвајање мора да се добро промеша како би се добила смеса у размери 70% тетрахлоретилена и 30% петролетера (са густоћом од приближно 1,26 g.cm-3). Материјал треба да одстоји 10 минута. Одвоји ће се две нове фракције: други талог и коначни флотат (< 1,26 g.cm-3). Други талог изолује се у Петријевој шољи (или на филтар папиру постављеном на левак) отварањем чепа док у левку за одвајање не остане само мало смесе растварача и коначни флотат. Преостала течност и коначни флотат прикупљају се одвојено на филтар папиру постављеном на левак. Зид левка за одвајањее испира се млазом петролетера како би се сакупио сав материјал из коначног флотата. Коначни флотат се мора осушити. Коначни флотат просејава се на 0,25 mm, а две добијене фракције испитују се ради детекције састојака копнених бескичмењака, осим ако се просејавање сматра непотребним.

2.1.4. Микроскопски преглед

2.1.4.1. Припрема препарата

Микроскопски препарат се припрема од талога и од флотата или сировог материјала, зависно од избора аналитичара. Према потреби, само за детекцију састојака копнених бескичмењака, припрема се и препарат од коначног флотата добијеног како је описано у тачки 2.1.3.4.4. Припремају се две добијене фракције (ситна и груба). Огледни делови фракција нанесени на стакла репрезентативни су за читаву фракцију. Потребно је припремити довољан број препарата како би се осигурало спровођење читавог испитног протокола који је одређен у тачки 2.1.4.2. Микроскопски препарати се припремају са одговарајућим средством за припрему препарата у складу са СОП-ом који је одредио ЕУРЛ-АП и објавио на својој интернет страници. Препарате је потребно покрити покровним стакалцима.

2.1.4.2. Дијаграм тока прегледа за детекцију честица животињског порекла у смешама, предсмешама и хранивима.

Припремљени микроскопски препарати посматрају се у складу са дијаграмима тока прегледа наведеним у Дијаграмима 1. и 2. Микроскопски прегледи спроводе се користећи светлосни микроскоп на талогу и, по избору лаборанта, на флотату или на сировини. Уз светлосни микроскоп може се користити и стереомикроскоп за грубе фракције. Осим тога, за детекцију састојака копнених бескичмењака посматрање се спроводи и на коначном флотату добијеном како је описано у тачки 2.1.3.4.4. у складу с Дијаграмом 3. Уз светлосни микроскоп може се користити и стереомикроскоп за грубе фракције. Сваки препарат прегледа се у целости и под различитим повећањима. Прецизна објашњења о коришћењу дијаграма тока прегледа детаљно су наведена у стандардизираним оперативним поступцима (СОП) које је утврдила референтна лабораториј ЕУ-а за протеине животињског порекла у храни за животиње (ЕУРЛ-АП) и објавио на својим интернетским страницама. Најмањи број препарата који се мора посматрати у свакој фази дијаграма тока прегледа мора строго да се поштује, осим у случајевима када цели материјал фракције не омогућава постизање утврђеног броја препарата, као у случају недобијања талога. При сваком одређивању употребљава се највише 6 препарата за бележење броја честица. Ако се припремају додатни препарати употребом специфичнијег средства за припрему препарата са особинама бојења, како је описано у тачки 2.1.2.1.4., на флотату или сировини за даљу карактеризацију структура (нпр. перје, коса, мишићне честице или честице крви), које су детектоване на препаратима добијенима употребом других средстава за припрему препарата, како је описано у тачки 2.1.2.1.3, број честица рачуна се на основу највише шест препарата по одређивању, укључујући додатне препарате са специфичнијим средством за припрему препарата. Додатни препарати припремљени од коначног флотата добијеног како је описано у точки 2.1.3.4.4. за детекцију састојака копнених бескичмењака не узимају се у обзир за идентификацију других порекла (копнени кичмењаци и рибе). За лакшу идентификацију врсте и порекла честица лаборант може да користи помоћне алате као што су системи за помоћ при одлучивању, збирке слика и референтни узорци.

2.1.4.3. Број одређивања

Одређивања се спроводе на различитим подузорцима од по 50 g.

Ако после првог одређивања спроведеног у складу са дијаграмом тока прегледа у складу са Дијаграмима 1. или 3. нису детектоване честице животињског порекла, није потребно спровести додатно одређивање, а о резултатима анализе извештава се кориштењем терминологије из тачке 2.1.5.1.

Ако се после првог одређивања спроведеног у складу са дијаграмом тока прегледа из Дијаграма 1. утврди једна или више честице животињског порекла датог порекла (тј. од копнених кичмењака или рибе), а порекло пронађених честица потврђује пријављени садржај узорка, није потребно спровести друго одређивање.

Ако је број честица животињског порекла датог порекла детектованих током првог одређивања већи од 5, о резултатима анализе потребно је известити по врсти животиње коришћењем терминологије из тачке 2.1.5.3. Иначе, о резултатима анализе потребно је известити по врсти животиње коришћењем терминологије из точке 2.1.5.2. Ако се након првог одређивања спроведеног у складу са дијаграмом тока прегледа из Дијаграма 3. утврди више од пет честица копнених бескичмењака, није потребно друго одређивање и резултат анализе за то порекло пријављује се у складу с формулацијом из тачке 2.1.5.3.

У другим случајевима, ако лабораторији достављена декларација садржаја, спроводи се друго одређивање на основу новог подузорка. Ако је, после другог одређивања спроведеног у складу са дијаграмом тока прегледа из Дијаграма 2. односно Дијаграма 3. збир честица животињског порекла датог порекла детектованих у два одређивања већи од 10, о резултатима анализе потребно је известити по животињском пореклу коришћењем терминологије из тачке 2.1.5.3. O резултатима анализе потребно је известити по врсти животиње кориштењем терминологије из тачке 2.1.5.2.

2.1.5. Приказ резултата

При извештавању о резултатима, лабораторија мора да наведе на којој врсти материјала је спроведена анализа (талог, флотат, коначни флотат или сировина).

У извештају се јасно наводи колико је одређивања спроведено и да ли је пре припреме препарата спроведено просејавање фракција у складу са тачком 2.1.3.4.3.3., или тачком

2.1.3.4.4.3. Лабораторијски извештај мора да садржи најмање информације о присутности састојака пореклом од копнених кичмењака или рибе. О различитим случајевима извештава се на следеће начине.

2.1.5.1. Није детектована ниједна честица датог порекла:

– „Колико је било могуће утврдити прегледом светлосним микроскопом, у достављеном узорку није детектовано присуство честица пореклом од копнених кичмењака.”

– „Колико је било могуће утврдити прегледом светлосним микроскопом, у достављеном узорку није детектовано присуство честица пореклом од рибе.”

– „Колико је било могуће утврдити прегледом светлосним микроскопом, у достављеном узорку није детектовано присуство честица пореклом од копнених бескичмењака.”

2.1.5.2. При спровођењу само једног одређивања детектовано је од 1 до 5 честица животињских порекла датог порекла или при спровођењу два одређивања детектовано је од 1 до 10 честица датог порекла (број детектоваих честица мањи је од прага утврђеног у стандардизираним оперативним поступцима (СОП) које је утврдила референтна лабораторија ЕУ-а за протеине животињског порекла у храни за животиње (ЕУРЛ-АП) и објавио на својим интернетским страницама):

Ако је спроведено само једно одређивање:

2.1.5.2.1. „Колико је било могуће утврдити прегледом светлосним микроскопом, у достављеном узорку детектовано је присуство највише 5 честица пореклом од копнених кичмењака. Честице су идентификоване као … [кости, хрскавица, мишић, длака, рогови, остало (наведите оно што одговара)]. Овако низак ниво присуства нижи је од прага утврђеног за ту микроскопску методу.”

2.1.5.2.2. „Колико је било могуће утврдити прегледом свјетлосним микроскопом, у достављеном узорку детектовано је присуство највише 5 честица пореклом од рибе. Честице су идентификоване као … [рибље кости, рибље крљушти, хрскавица, мишић, отолит, шкрге, остало (наведите оно што одговара)]. Овако низак ниво присуства нижи је од прага утврђеног за ту микроскопску методу.”

Ако су проведена два одређивања:

2.1.5.2.3. „Колико је било могуће утврдити прегледом светлосним микроскопом, у два одређивања у достављеном узорку детектовано је присуство највише 10 честица пореклом од копнених кичмењака. Честице су идентификоване као … [кости, хрскавица, мишић, длака, рогови, остало (наведите оно што одговара)]. Овако низак ниво присуства нижи је од прага утврђеног за ту микроскопску методу.”

2.1.5.2.4. „Колико је било могуће утврдити прегледом светлосним микроскопом, у два одређивања у достављеном узорку детектовано је присуство највише 10 честица пореклом од рибе. Честице су идентификоване као … [рибље кости, рибље крљушти, хрскавица, мишић, отолит, шкрге, остало (наведите оно што одговара)]. Овако низак ниво присуства нижи је од прага утврђеног за ту микроскопску методу.”

2.1.5.2.5. „Колико је било могуће утврдити прегледом светлосним микроскопом, у два одређивања у достављеном узорку детектовано је присуство највише 10 честица пореклом од копнених бескичмењака. Честице су идентификоване као ... [фрагменти кутикуле, делови усне дупље, мишићи, трахеалне структуре, остало (наведите оно што одговара)]. Овако низак ниво присуства нижи је од прага утврђеног за ту микроскопску методу.”

Додатно:

У случају претходног просејавања узорка, у лабораторијском извештају мора бити наведено у којој су фракцији (просејана фракција, пелетирана фракција или зрна) утврђене честице животињског порекла, јер детекција честица животињског порекла само у просејаној фракцији може бити знак загађења из околине.

2.1.5.2.6. Ако се детектују само честице животињског порекла које се не могу категоризовати као честице пореклом од копнених кичмењака или рибе (нпр. мишићна влакна), у извештају се наводи да су детектоване само такве честице животињског порекла и да се не може искључити да потичу од копнених кичмењака.

2.1.5.3. При спровођењу само једног одређивања утврђено је више од 5 честице животињског порекла датог порекла или је при спровођењу два одређивања детектовано више од 10 честица датог порекла:

Ако је проведено само једно одређивање:

2.1.5.3.1. „Колико је било могуће утврдити прегледом светлосним микроскопом, у достављеном узорку детектовано је присуство више од 5 честица пореклом од копнених кичмењака. Честице су идентификоване као … [кости, хрскавица, мишић, длака, рогови, остало (наведите оно што одговара)].”

2.1.5.3.2. „Колико је било могуће утврдити прегледом светлосним микроскопом, у достављеном узорку детектовано је присуство више од 5 честица пореклом од рибе. Честице су идентификоване као … [рибље кости, рибље крљушти, хрскавица, мишић, отолит, шкрге, остало (наведите оно што одговара)].”

2.1.5.3.3. „Колико је било могуће утврдити прегледом светлосним микроскопом, у достављеном узорку детектовано је присуство више од 5 честица пореклом од копнених бескичмењака. Честице су идентификоване као … [фрагменти кутикуле, делови усне дупље, мишићи, трахеалне структуре, остало (наведите оно што одговара)].”

Ако су спроведена два одређивања:

2.1.5.3.4. „Колико је било могуће утврдити прегледом светлосним микроскопом, у два одређивања у достављеном узорку детектовано је присуство више 10 честица пореклом од копнених кичмењака. Честице су идентификоване као … [кости, хрскавица, мишић, длака, рогови, остало (наведите оно што одговара)].”

2.1.5.3.5. „Колико је било могуће утврдити прегледом светлосним микроскопом, у два одређивања у достављеном узорку детектовано је присуство више 10 честица пореклом од рибе. Честице су идентификоване као … [рибље кости, рибље кршушти, хрскавица, мишић, отолит, шкрге, остало (наведите оно што одговара)].”

2.1.5.3.6. „Колико је било могуће утврдити прегледом светлосним микроскопом, у два одређивања у достављеном узорку детектовано је присуство више 10 честица пореклом од копнених бескичмењака. Честице су идентификоване као … [фрагменти кутикуле, делови усне дупље, мишићи, трахеалне структуре, остало (наведите оно што одговара)].”

Додатно:

2.1.5.3.7. У случају претходног просејавања узорка, у лабораторијском извештају мора да буде наведено у којој су фракцији (просејана фракција, пелетирана фракција или зрна) детектоване честице животињског порекла, јер детекција честице животињског порекла само у просејаној фракцији може бити знак загађења из околине.

2.1.5.3.8. Ако се детектују само честице животињског порекла које се не могу категоризовати као честице пореклом од копнених кичмењака или рибе (нпр. мишићна влакна), у извештају се наводи да су откривене само такве честице животињског порекла и да се не може искључити да потичу од копнених кичмењака.

2.2. Ланчана реакција полимеразe (PCR)

2.2.1. Начело

Фрагменти дезоксирибонуклеинске киселине (DNK) животињског порекла, који могу бити присутни у хранивима и смешама за исхрану животиња откривају се техником генетичког умножавања путем PCR која циља DNK секвенце значајне за врсту.

PCR метода захтева најпре екстракцију DNK. Умножавање се врши касније на тако добијеном DNK екстракту како би се открила циљана животињска врста.

2.2.2. Реагенси и опрема

2.2.2.1. Реагенси

2.2.2.1.1. Реагенси за екстракцију DNK

Употребљавају се само реагенси које је одобрио ЕУРЛ-АП и објавио на својој интернет страници.

2.2.2.1.2. Реагенси за умножавање генетичког материјала

2.2.2.1.2.1. Прајмери и пробе

Употребљавају се само прајмери и пробе са секвенцама олигонуклеотида које је валидовала ЕУРЛ-АП и објавила на својој интернет страници2

2.2.2.1.2.2. Мастер микс

Употребљава се само мастер микс који не садржи реагенсе који би могли проузроковати лажне резултате због присуства животињске DNK3

2.2.2.1.2.3. Реагенси за деконтаминацију

2.2.2.1.2.3.1. Раствор хлороводоничне киселине (0,1 Н),

2.2.2.1.2.3.2. Избељивач (раствор натријум хипохлорита са 0,15% активног хлора),

2.2.2.1.2.3.3. Нерђајући реагенси за деконтаминацију скупих уређаја као што су аналитичке ваге;

2.2.2.2. Опрема

2.2.2.2.1. Аналитичка вага с прецизношћу од 0,001 g,

2.2.2.2.2. Прибор за млевење;

2.2.2.2.3. Уређај за PCR (thermocycler) који омогућава PCR у стварном времену;

2.2.2.2.4. Микроцентрифуга за микроепрувете,

2.2.2.2.5. Комплет микропипета које омогућавају пипетирање од 1 μl до 1 000 μl;

2.2.2.2.6. Стандардна пластична опрема за микробиологију: микроепрувете за микроцентрифугу, пластични наставци с филтрима за микропипете, одговарајуће плоче за PCR уређај (thermocycler),

2.2.2.2.7. Замрзивачи за складиштење узорака и реагенса

1) Попис ових прајмера и проба за сваку циљану животињску врсту доступан је на интернет страници ЕУРЛ-АП-а,

2) Примери мастер микс раствора који су функционални доступни су на интернет страници ЕУРЛ-АП-а.

2.2.3. Узорковање и припрема узорка

2.2.3.1. Узорковање

Користи се репрезентативан узорак који је узет у складу са Одељком 3. Методе узорковања, из овог прилога;

––––––––

2 Попис ових прајмера и проба за сваку циљану животињску врсту доступан је на интернет страници ЕУРЛ-АП.

3 Примери мастер микса који су функционални, доступни су на интернет страници ЕУРЛ-АП.

2.2.3.2. Припрема узорка

При припреми лабораторијских узорака до екстракције DNK потребно је поштовати опште одредбе о аналитичким методама за храну за животиње из овог прилога. Најмање 50 g узорка се подузоркује за анализу и самеље. Припрема узорка мора се спровести у другом простору од оног који се користи за екстракцију DNK и умножавање генетичког материјала у складу са стандардом ISO 24276.

Припреме се два тестна узорка, сваки од најмање 100 mg;

2.2.4. Екстракција DNK

Екстракција DNK спроводи се на сваком припремљеном тестном узорку користећи СОП који је успоставила ЕУРЛ-АП и објавила на својој интернет страници.

За сваку серију екстракције DNK припремају се два контролна узорка како је описано у ISO стандарду 24276:

1) слепи контролни узорак екстракције;

2) позитивни контролни узорак екстракције DNK.

2.2.5. Умножавање генетичког материјала

Генетички материјал се умножава користећи методе валидоване за сваку врсту која захтева идентификацију. Те методе су прописане у СОП који је успоставила ЕУРЛ-АП и објавила на својој интернет страници. Сваки екстракт DNK анализира се у најмање два различита разређења како би се оценила инхибиција.

За сваку циљану врсту припремају се два контролна узорка која се умножавају како је описано у ISO стандарду 24276:

1) позитивни контролни узорак с циљаном DNK употребљава се за сваку плочу или серију анализа PCR,

2) контролни узорак реагенаса за умножавање (контролни узорак без матрице) употребљава се за сваку плочу или серију анализа PCR.

2.2.6. Тумачење и приказ резултата

У извештају о резултатима, лабораторија мора да наведе најмање масу употребљеног тестног узорка, коришћене технике за екстракцију, број спроведених одређивања и границу детекције методе.

Резултати се не смеју тумачити и саопштавати ако позитивни контролни узорак екстракције DNK и позитивни контролни узорак с циљаним DNK не омогућавају одређивање циљане врсте при анализи, док је резултат контролног узорка реагенса за умножавање негативан.

У случају да резултати два тестна узорка нису доследни, потребно је поновити корак генетичког умножавања. Ако лабораторија сумња да разлог за неусклађеност могу да буду екстракти DNK, спроводи се нова екстракција DNK и умножавање генетечког материјала пре тумачења резултата.

Коначни приказ резултата мора да се темељи на интеграцији и тумачењу резултата два тестна узорка у складу са СОП-ом који је успоставила ЕУРЛ-АП и објавила на својој интернет страници.

2.2.6.1. Негативни резултат

О негативном резултату се извештава на следећи начин:

1) У достављеном узорку није утврђена DNK пореклом од X (X је животињска врста или група животињских врста која је предмет испитивања);

2.2.6.2. Позитивни резултат

О позитивном резултату се извештава на следећи начин:

1) DNK пореклом од X је утврђена у достављеном узорку (X је животињска врста или група животињских врста која је предмет испитивања).

3. МЕТОДЕ УЗОРКОВАЊА

3.1. Сврха и област примене

Узорци за службену контролу хране за животиње узимају се у складу са методама описаним у овом прилогу. Тако добијени узорци сматрају се репрезентативним за узорковане делове.

Сврха репрезентативног узорковања је добијање мање количине из серије на начин да одређивање било које посебне особине те количине представља средњу вредност особине серије. Серија се узоркује поновљеним узимањем појединачних узорака при различитим јединственим положајима у серији. Ти појединачни узорци комбинују се мешањем до форме збирног узорка из кога се репрезентативним дељењем припремају репрезентативни коначни узорци.

Ако се визуелном инспекцијом утврди разлика у квалитету делова хране за животиње намењене узорковању у односу на преостали део исте серије, такви делови раздвајају се од остатка хране за животиње и са њима се поступа као са одвојеном подсеријом. Ако није могуће разделити храну за животиње у одвојене подсерије, храна за животиње узоркује се као једна серија. У овом случају се ове чињенице наводе у извештају о узорковању.

Ако се утврди да храна за животиње исте класе или описа, узоркована у складу са одредбама овог правилника, не испуњава прописане услове, сматра се да сва храна за животиње из те серије не испуњава прописане услове, осим ако се детаљном проценом утврди да нема доказа да остатак серије не испуњава прописане услове безбедности.

3.2. Појмови

Серија, лот или шаржа је идентификована количина хране за животиње за коју је утврђено да поседује заједничке особине као што је порекло, врста, начин паковања, субјекат који пакује производе, пошиљалац или означавање, а у случају производног поступка, производна јединица из јединственог објекта која користи јединствене производне параметре или неколико таквих јединица при непрекинутој производњи и збирном складиштењу.

Узорковани део је серија или идентификовани део серије или подсерије.

Запечаћени узорак је узорак запечаћен на начин да узорку није могуће приступити без ломљења или уклањања печата.

Појединачни узорак је количина која се узима из једне тачке узорка.

Збирни узорак је збир појединачних узорака узетих из истог узоркованог дела.

Редуковани узорак је део збирног узорка добијен поступком репрезентативног смањивања збирног узорка.

Коначни узорак је део редукованог узорка или хомогенизованог збирног узорка.

Лабораторијски узорак је узорак намењен за лабораторију (како је примљен у лабораторију) који може бити коначан, редукован или збирни.

3.3. Опште одредбе

Узорке узимају особе које су за то овлашћене.

Узорак мора бити запечаћен на начин да узорку није могуће приступити без ломљења или уклањања печата. Ознака печата треба бити јасно препознатљива и видљива. Алтернативно, узорак се може држати у посуди која се затвара на начин да се не може отворити без неповратног оштећења чиме се избегава поново коришћење такве посуде.

Узорак мора бити неизбрисиво означен и мора се идентификовати на начин да постоји јасна веза са извештајем о узорку.

Из сваког збирног узорка узимају се најмање два коначна узорка, и то: најмање један за контролу и један за субјекта у пословању храном за животиње. Евентуално, један коначан узорак може бити узет као референтни узорак. Ако је целокупан збирни узорак хомогенизован, коначни узорци узимају се из хомогенизованог збирног узорка.

3.4. Опрема

3.4.1. Опрема за узорковање мора бити израђена од материјала који не могу контаминирати производе намењене узорковању. Опрема намењена вишеструкој употреби мора бити једноставна за чишћење како би се избегла унакрсна контаминација.

3.4.2. Препоручена опрема за узорковање чврсте хране за животиње

3.4.2.1. Ручно узорковање

3.4.2.1.1. Лопатица с равним дном и вертикалним страницама

3.4.2.1.2. Сонда за узорковање са дугим процепом или преградама. Димензије сонде за узорковање морају одговарати особинама узорка (дубина посуде, величина вреће итд.) и величини честица хране за животиње.

Ако сонда за узорковање има неколико отвора, они се одвајају преградама или распоређеним отворима како би се осигурало да се узорак узима на различитим местима дуж сонде.

3.4.2.2. Механичко узорковање

За узорковање хране за животиње која је у протоку може се користити одговарајућа механичка опрема. Одговарајућа механичка опрема значи да се узоркује најмање целокупна секција читавог протока.

Узорковање хране за животиње у покрету (при великим брзинама протока) може се спровести аутоматским узоркивачима.

3.4.2.3. Разделник

Ако је могуће и одговарајуће, опрема намењена за раздвајање узорка на приближно једнаке делове треба да се користи за припрему редукованих узорака на репрезентативан начин.

3.5. Захтеви у погледу количина у појединачним узорцима

Захтеви у погледу количина из тач. 3.5.1. и 3.5.2. у вези са бројем појединачних узорака примењују се за узорковане делове у величинама до највише 500 t који се могу узорковати на репрезентативан начин. Описани поступак узорковања важећи је и за количине веће од прописане максималне величине узоркованог дела под условом да се највећи број појединачних узорака из табеле која следи занемари, при чему се број појединачних узорака одређује формулом квадратног корена наведеном у одговарајућем делу поступка (видети тачку 3.5.3), а најмањи збир величина узорка пропорционално се увећава. Овим се не спречава раздвајање велике серије у неколико мањих подсерија и узорковање сваке подсерије у складу са поступком описаним у тачкама 3.5.1. и 3.5.2.

Величина узоркованог дела мора бити таква да сваки од његових саставних делова може бити узоркован.

За јако велике серије или подсерије (> 500 t) и за серије које се превозе или складиште на такав начин да је узорковање немогуће у складу са поступком узорковања предвиђеним тачкама 3.5.1. и 3.5.2, примењује се поступак узорковања из тачке 3.5.3.

У случају да је субјекат у пословању храном за животиње обавезан да испуни услове у складу са овим правилником у оквиру обавезног мониторинга, тај субјекат може одступити од предвиђених количинских захтева како би се у обзир узеле оперативне карактеристике под условом да је доказао истоветност поступка узорковања у погледу репрезентативности и после одобрења надлежног органа.

Изузетно, уколико није могуће спровести наведену методу узорковања у вези са количинским захтевима због неприхватљиве комерцијалне штете на серији (због облика паковања, превозних средстава, начина складиштења, итд.), може се применити алтернативни начин узорковања под условом да је што репрезентативнији и у потпуности описан и документован.

3.5.1. Захтеви у погледу количина у појединачним узорцима при контроли супстанци или производа равномерно расподељених у храни за животиње

3.5.1.1. Чврста храна за животиње у расутом стању

Квадратни корен из двадесетог дела укупног броја t који чине узорковани део(*), до највише 40 појединачних узорака

(*) Када добијени број није цео број, заокружује се на следећи цео број.

3.5.1.2. Текућа храна за животиње у расутом стању

(*) Ако није могуће добити хомогену течност, потребно је увећати број појединачних узорака.

3.5.1.3. Пакована храна за животиње

Храна за животиње (у чврстом или течном стању) може се паковати у вреће, лименке, бачве, итд, које су у табели означене као јединице. Велике јединице (≥ 500 kg или l) морају се узорковати у складу са одредбама предвиђеним за храну за животиње у расутом стању (видети тачке 3.5.1.1. и 3.5.1.2).

(*) У случају када отварање јединице може утицати на анализу (нпр. кварљива влажна храна за животиње), неотворена јединица служи као појединачни узорак.

(**) За јединице чији садржај не прелази 1 kg или једну l, појединачни узорак је садржај једне оригиналне јединице.

(***) Када добијени број није цео број, заокружује се на следећи цео број.

3.5.1.4. Блокови или камен за лизање

Најмање један блок или камен за лизање за узорковање по узоркованом делу од 25 јединица, до највише четири блока или камена за лизање.

За четири блока или камена за лизање којима појединачна тежина није већа од 1 kg, појединачни узорак садржај је једног блока или једног камена за лизање.

3.5.1.5. Кабаста хранива

(*) Када добијени број није цео број, заокружује се на следећи цео број.

3.5.2. Захтеви у погледу количина у појединачним узорцима при контроли супстанци или производа равномерно расподељених у храни за животиње

Захтеви у погледу количина у појединачним узорцима користе се у следећим ситуацијама:

1) контрола афлатоксина, ражаних гљивица, осталих микотоксина и штетних ботаничких нечистоћа у храни за животиње,

2) контрола унакрсне контаминације састојком, укључујући и генетски модификованим материјалом или супстанцом за коју се очекује неуједначена дистрибуција у храни за животиње.

Ако постоји јака сумња за постојање неуједначене дистрибуције и у случају унакрсне контаминације састојком или супстанцом у смеши, примењују се количински захтеви наведени у табели:

3.5.3. Захтеви у погледу количина у појединачним узорцима код врло великих серија

У случају великих узоркованих делова (узорковани делови > 500 t), број појединачних узорака које треба узорковати = 40 појединачних узорака + квадратни корен из количине t при контроли супстанци или производа равномерно распоређених у целом узорку или 100 појединачних узорака + квадратни корен из количине t при контроли састојака или супстанци вероватно неравномерно распоређених у храни за животиње.

3.6. Захтеви у погледу количина у збирном узорку

(*) Ако се узоркује храна за животиње високе вредности, може се узети мања количина збирног узорка под условом да се то опише и наведе у извештају о узорковању.

(**) Збирни узорак за контролу присутности генетски модификованог материјала мора да садржи најмање 35 000 семенки/зрна. Према томе, величина збирног узорка за кукуруз мора бити најмање 10,5 kg, а за соју 7 kg. За остало семење као што је јечам, просо, зоб, пиринач, пшеница и семе репе, збирна величина узорка од 4 kg одговара количини од 35 000 семенки.

(***) У случају паковане хране за животиње, можда неће бити могуће постићи величину од 4 kg за збирни узорак, зависно од величине појединачних јединица.

(****) У случају кабасатог хранива или хране за животиње ниске специфичне тежине (нпр. сено, слама), збирни узорак треба да има најмање 1 kg.

3.7. Захтеви у погледу количина у коначним узорцима

3.7.1. Коначни узорци

Потребна је анализа најмање једног коначног узорка. Количина коначног узорка за анализу не сме бити мања од:

(*) Коначни узорак за контролу присутности генетски модификованог материјала мора да садржи најмање 10 000 семенки/зрна. Према томе, за кукуруз величина коначног узорка мора бити најмање 3 000 g, а за соју 2 000 g. За остало семење као што је јечам, просо, зоб, пиринач, раж, пшеница и семе репе, збирна величина узорка од 500 g одговара више од 10 000 семенки.

(**) Ако је збирни узорак знатно мањи од 4 kg или l, може се узети и мања количина коначног узорка под условом да се то опише и наведе у извештају о узорковању.

(***) При узорковању махунарки, зрна житарица и орашастог воћа за одређивање остатака пестицида, најмања величина коначног узорка износи 1 kg.

3.8. Методе узорковања за врло велике серије или серије које се складиште или превозе на начин да узорковање у читавој серији није могуће

3.8.1. Општа начела

Ако начин превоза или складиштења серије онемогућава узимање појединачних узорака у читавој серији, узорковање таквих серија треба да се спроведе када је серија у протоку.

Код великих складишта намењених складиштењу хране за животиње, одговарајућа би била опрема у складишту која омогућује (аутоматско) узорковање у читавој складиштеној серији.

Код примене поступака узорковања предвиђених у овом поглављу субјекат у пословању храном за животиње или њихов представник обавештава се о поступку узорковања. Ако субјекат у пословању храном за животиње или његов представник доведе у питање тај поступак узорковања, субјекат у пословању храном за животиње или његов представник омогућава надлежном органу узроковање у читавој серији на властити трошак.

3.8.2. Велике серије које се превозе бродом

3.8.2.1. Динамичко узорковање великих серија које се превозе бродом

Узорковање великих серија у бродовима спроводи се по могућности док је производ у протоку (динамичко узорковање).

Узорковање се врши у бродском складишту (субјект који се може физички одвојити). Међутим, бродска складишта делимично се празне једно за другим тако да почетно физичко одвајање више не постоји после преноса у складишне објекте.

Узорковање се може спровести у функцији почетног физичког раздвајања или у функцији раздвајања после преноса у складишне објекте.

Истовар брода може трајати неколико дана. Обично се узорковање мора спровести у редовним интервалима током трајања истовара. Међутим, није увек могуће или одговарајуће да инспектор буде присутан на узорковању током читавог трајања истовара. У том случају узорковање се спроводи за део (узорковани део) читаве серије. Број појединачних узорака одређује се узимањем у обзир узоркованог дела.

Ако се узоркује део серије хране за животиње исте класе или описа и утврди се да тај део серије не одговара прописаним условима, сматра се да сва храна за животиње из те серије не испуњава прописане услове, осим ако се детаљном проценом утврди да нема доказа да остатак серије не испуњава прописане услове у погледу безбедности.

Присутност инспектора потребна је чак и када је службени узорак узет аутоматски. Међутим, ако се аутоматско узорковање спроводи са унапред задатим параметрима који се не могу мењати током узорковања, а појединачни узорци се сакупљају у запечаћени контејнер чиме се спречава свака могућа превара, тада је присутност инспектора потребна само на почетку узорковања, при свакој промени пријемног контејнера за сакупљање узорака и на крају узорковања.

3.8.2.2. Статичко узорковање серија које се превозе бродом

Ако се узорковање спроводи статичким узорковањем, примењује се истоветни поступак који је предвиђен за складишне објекте (силосе) којима се приступа са горње стране (видети тачку 3.8.4.1).

Узорковање се мора спровести на приступачном делу (одозго) серије/бродског складишта. Број појединачних узорака одређује се водећи рачуна о величини узоркованог дела. Ако се узоркује део серије хране за животиње исте класе или описа и утврди се да тај део серије не одговара прописаним условима, сматра се да сва храна за животиње из те серије не испуњава прописане услове, осим ако се детаљном проценом утврди да нема доказа да остатак серије не испуњава прописане услове у погледу безбедности.

3.8.3. Узорковање великих серија које се складиште у складиштима

Узорковање се мора спровести на приступачном делу серије. Број појединачних узорака одређује се узимајући у обзир величину узоркованог дела. Ако се узоркује део серије хране за животиње исте класе или описа и утврди се да тај део серије не одговара прописаним условима, сматра се да сва храна за животиње из те серије не испуњава прописане услове, осим ако се детаљном проценом утврди да нема доказа да остатак серије не испуњава прописане услове у погледу.

3.8.4. Узорковање у складишним објектима (силосима)

3.8.4.1. Узорковање у силосима у којима се приступа одозго

Узорковање се мора спровести на приступачном делу серије. Број појединачних узорака одређује се водећи рачуна о величини узоркованог дела. Ако се узоркује део серије хране за животиње исте класе или описа и утврди се да тај део серије не одговара прописаним условима, сматра се да сва храна за животиње из те серије не испуњава прописане услове, осим ако се детаљном проценом утврди да нема доказа да остатак серије не испуњава прописане услове у погледу безбедности.

3.8.4.2. Узорковање у силосима у којима се не приступа одозго (затворени силоси)

3.8.4.2.1. Силоси којима се не приступа одозго (затворени силос) величине > 100 t

Храна за животиње у тим силосима не може се узорковати на статички начин. Ако се храна за животиње у силосу мора узорковати и не постоји могућност премештања пошиљке, потребно је да субјекат у пословању храном за животиње обавести инспектора о томе када ће се силос истоварити како би се омогућило узорковање у тренутку када је храна за животиње у протоку.

3.8.4.2.2. Силос коме се не приступа одозго (затворени силос) величине < 100 t

Поступак узорковања укључује испуштање у пријемни контејнер количине од 50 до 100 kg и узимање узорка из њега. Величина збирног узорка одговара читавој серији, а број појединачних узорака односи се на количину из силоса пуштену у пријемни контејнер за узорковање. Ако се узоркује део серије хране за животиње исте класе или описа и утврди се да тај део серије не одговара прописаним условима, сматра се да сва храна за животиње из те серије не испуњава прописане услове, осим ако се детаљном проценом утврди да нема доказа да остатак серије не испуњава прописане услове у погледу безбедности.

3.8.5. Узорковање хране за животиње у расутом стању у затвореним посудама

Такве серије често се могу узорковати само после истовара. У одређеним случајевима није могуће обавити истовар на месту утовара или контроле, па се узорковање обавља при истовару тих посуда.

3.9. Упутства за узимање, припремање и паковање узорака

3.9.1 Опште одредбе

Узорци се узимају и припремају без непотребног одлагања уз придржавање мера опреза којима се спречава промена састава или контаминација производа. Инструменти, радне површине и посуде за прихват узорака морају бити чисти и суви.

3.9.2. Појединачни узорци

Појединачни узорци узимају се насумично из целог узорка и морају бити приближно једнаке величине.

Величина појединачног узорка износи најмање 100 g или 25 g за кабаста хранива или храну за животиње ниске специфичне тежине.

Ако се у складу са правилима поступка узорковања утврђеним у тачки 3.8. мора узети мање од 40 појединачних узорака, величина појединачних узорака одређује се у функцији потребне величине збирног узорка који се мора постићи (видети тачку 3.6).

У случају узорковања малих серија паковане хране за животиње где је према захтевима у погледу количине потребно узети ограничен број појединачних узорака, појединачни узорак је садржај једне оригиналне јединице чији садржај не прелази 1 kg или једну l.

У случају узорковања паковане хране за животиње састављене од малих јединица (нпр. < g), величина појединачног узорка зависи од величине јединице.

3.9.2.1. Храна за животиње у расутом стању

Према потреби узорковање се може извести при премештању узорка (при утовару или истовару).

3.9.2.2. Пакована храна за животиње

После одабира потребног броја јединица за узорковање у складу са тачком 3.5, сондом или лопатицом узима се део садржаја сваке јединице. Према потреби, узорци се могу узети после одвојеног пражњења јединица.

3.9.2.3. Хомогенизована или за хомогенизовање примерена течна или полутечна храна за животиње

После одређивања потребног броја јединица за узорковање из тачке 3.5, њихов се удео према потреби хомогенизује и из сваке се јединице узима одређена количина.

Појединачни узорци се могу узимати при пражњењу садржаја контејнера.

3.9.2.4. Течна или полутечна храна за животиње која није прикладна за хомогенизовање

После одређивања броја јединица за узорковање из тачке 3.5, узорци се узимају са различитих нивоа.

Узорци се могу узети и за време пражњења удела, али се прва количина мора одбацити.

У оба случаја укупан волумен не сме бити мањи од 10 l.

3.9.2.5. Блокови или камен за лизање

После одређивања броја блокова или камена за лизање намењених узорковању из тачке 3.5, може се узети део сваког блока или камена за лизање. У случају сумње да блок или камен за лизање није одговарајући за хомогенизовање, читав блок или камен за лизање може се узети као узорак.

За четири блока или камена за лизање којима појединачна тежина није већа од 1 kg, појединачни узорак је садржај једног блока или једног камена за лизање.

3.9.3. Припрема збирних узорака

Појединачни узорци помешају се тако да створе збирни узорак.

3.9.4. Припрема коначних узорака

Материјал збирног узорка мора се пажљиво измешати4.

1) Сваки узорак се сакупи у одговарајућу посуду. Потребно је предузети све мере опреза како би се током превоза или складиштења спречила промена састава узорка, контаминација или загађење;

––––––––

4 Све грудве се разбију (према потреби, тако да се одвоје и затим врате у узорак).

2) У случају контроле супстанце или производа равномерно расподељених у храни за животиње, збирни узорак може се репрезентативно смањити на најмање 2 kg или 2 l (редукован узорак)5, по могућности механичким или аутоматским разделником. За контролу присуства остатака пестицида у махунаркама, зрнима житарица и орашастом воћу, најмања величина редукованог узорка износи 3 kg. Ако својства хране за животиње не дозвољавају коришћење разделника или разделник није доступан, узорак се смањује четвртањем. Потом се из смањених узорака припреме коначни узорци (за потребе контроле и референтне сврхе) приближно једнаке величине у складу са захтевима у погледу количина из тачке 3.7. У случају контроле производа, укључујући генетски модификовани материјал или супстанце вероватно неравномерно распоређених у храни за животиње, збирни узорак је:

(1) потпуно хомогенизован и накнадно раздељен у коначне узорке или

(2) редукован на најмање 2 kg или 2 l6 механичким или аутоматским разделником. Само у случају када својства хране за животиње онемогућавају коришћење разделника, узорак се може по потреби смањити четвртањем.

3.9.5. Паковање узорака

Посуде или паковања запечаћени су и означени тако да их није могуће отворити без оштећења печата. Цела етикета мора бити укључена у печат.

3.9.6 Слање узорака у лабораторију

Узорак се без непотребног одлагања шаље у одређену аналитичку лабораторију, заједно са подацима потребним аналитичару.

3.10. Подаци о узорковању

О сваком узорку морају се водити евиденције како би се сваки узорковани део и његова величина могла сигурно препознати.

У евиденцијама се наводи свако одступање од поступка узорковања предвиђеног овим прилогом.

4. ОПШТЕ ОДРЕДБЕ О АНАЛИТИЧКИМ МЕТОДАМА ЗА ХРАНУ ЗА ЖИВОТИЊЕ

4.1. Припрема узорака за анализу

4.1.1. Сврха

У наведеним поступцима описује се припрема узорака за анализу, који се шаљу надзорним лабораторијама након узорковања спроведеног у складу са одредбама из овог прилога.

Ти лабораторијски узорци морају се припремити тако да измерене количине буду хомогене и репрезентативне за коначне узорке, како су предвиђене за методе анализе.

4.1.2. Мере опреза

Поступак припремања узорака зависи од аналитичких метода које се користе и производа и супстанци које се контролишу. Због тога је врло важно осигурати да примењени поступак за припремање узорка буде примерен аналитичкој методи која се користи и производима или супстанцама које се контролишу.

Сви потребни поступци морају се спровести на начин којим се у највећој могућој мери спречава контаминација и промена састава узорка.

Млевење, мешање и просејавање мора се вршити без одлагања како би се узорак мање излагао ваздуху и светлости. Млинови и дробилице који би могли знатно загрејати узорак, не могу се користити.

Препоручује се ручно млевење хране за животиње која је посебно осетљива на топлоту. Треба се побринути да сама опрема не буде извор контаминације.

Ако се припрема не може обавити без знатне промене удела влаге у узорку, одређује се удео воде пре и после припреме.

––––––––

5 Осим код кабастих хранива или хране за животиње ниске специфичне тежине.

6 Осим код кабастих хранива или хране за животиње ниске специфичне тежине.

4.1.3. Поступак

4.1.3.1. Општи поступци

Количине за анализу (тестни аликвот) узимају се из коначног узорка. Не препоручује се дељење узорака методом купасте гомиле и четвртања, јер се на тај начин могу добити тестни аликвоти са високом грешком дељења.

4.1.3.1.1. Храна за животиње која се може самлети без додатне обраде

Просејани коначни узорак се промеша и прикупи у чисту и суву посуду са херметичким затварачем. Непосредно пре мерења количине за анализу (тестни аликвот), узорак се поновно промеша како би се осигурала потпуна хомогенизација.

4.1.3.1.2. Храна за животиње која се може самлети после сушења

Ако се у аналитичким методама не наводи другачије, коначни узорак се суши, тако да се удео воде снизи на 8%–12%. Затим се наставља у складу с тачком 4.1.3.1.1.

4.1.3.1.3. Течна или полутечна храна за животиње

Коначни узорак треба да се прикупи у чисту и суву посуду са херметичким затварачем. Непосредно пре мерења количине за анализу (тестни аликвот), узорак се промеша како би се осигурала потпуна хомогенизација.

4.1.3.1.4. Остала храна за животиње

Коначни узорци који се не могу припремити у складу са једним од наведених поступака обрађују се било којим другим поступком којим се осигурава да је количина узорка одмерена за анализу (тестни аликвот) хомогена и репрезентативна за коначне узорке.

4.1.3.2. Посебни поступак при провери визуелном инспекцијом или микроскопијом или када је читав збирни узорак хомогенизован

1) У случају провере визуелном инспекцијом (без коришћења микроскопа), за проверу се користи читав лабораторијски узорак;

2) У случају микроскопске провере, у лабораторији се може смањити збирни узорак или додатно смањити редуковани узорак. Коначни узорци за потребе призивног поступка и у референтне сврхе узимају се после поступка који је једнак поступку који следи за коначни узорак за спровођење;

3) Ако је читав збирни узорак хомогенизован, коначни узорци узимају се из хомогенизованог збирног узорка.

4.1.4. Чување узорака

Узорци се морају чувати на температури која неће променити њихов састав. Узорци намењени за анализу витамина или супстанце посебно осетљивих на светлост морају да се чувају у условима у којима узорак није под штетним утицајем светла.

4.2. Одредбе о реагенсима и опреми који се користе у аналитичким методама

4.2.1. Ако се у аналитичким методама не наводи другачије, сви реагенси морају да буду аналитичке чистоће (pro analisi (p.a.)). Код анализе трагова, чистоћа реагенса мора се проверити слепом пробом. Зависно о добијених резултата, може бити потребно додатно прочишћавање реагенса.

4.2.2. Код свих поступака из аналитичких метода који укључују припремање раствора, разређивање, испирање или прање, код којих се не наводи врста коришћеног растварача или разређивача, користи се вода. По правилу, вода мора бити деминерализована или дестилована. У посебним случајевима, наведеним у аналитичким методама, воду треба прочистити посебним поступцима.

4.2.3. С обзиром на опрему која се уобичајено налази у контролним лабораторијима, у аналитичким методама се наводе само посебни инструменти и опрема или они који захтевају посебан начин употребе. Они морају бити чисти, посебно код одређивања врло малих количина супстанце.

4.3. Примена аналитичких метода и приказ резултата

4.3.1. Поступак екстракције

У неколико метода утврђен је посебан поступак екстракције. Осим поступка наведеног у методи, могу се користити и други поступци екстракције, под условом да се коришћеним поступком прочишћавања за анализирану матрицу доказано постижу аналитички резултати једнако вредни поступку наведеном у методи.

4.3.2. Поступак прочишћивања

У неколико метода утврђен је посебан поступак прочишћавања. Осим поступка наведеног у методи, могу се користити и други поступци прочишћавања, под условом да се коришћеним поступком прочишћавања за анализирану матрицу доказано постижу аналитички резултати једнако вредни поступку наведеном у методи.

4.3.3. Број поступака одређивања

Код анализе непожељних супстанци, ако је резултат првог одређивања знатно нижи (> 50%) од спецификације која се контролише, нису потребни додатни поступци одређивања под условом да су коришћени примерени поступци за осигурање квалитета. У осталим случајевима потребна је двострука анализа (секундарно одређивање) како би се искључила могућност унутрашње унакрсне контаминације или случајне замене узорака. За потврду усклађености користи се средња вредност два одређивања, узимајући у обзир несигурност мерења.

При контроли означеног удела супстанце или састојка, ако се резултатом првог одређивања потврди означени удео, тј. ако је резултат анализе унутар прихватљивих граница одступања од означеног удела, нису потребни додатни поступци одређивања под условом да су коришћени примерени поступци за осигурање квалитета. У осталим случајевима потребна је двострука анализа (секундарно одређивање) како би се искључила могућност унутрашње унакрсне контаминације или случајне замене узорака. За потврду усклађености користи се средња вредност са два одређивања, узимајући у обзир несигурност мерења.

4.3.4. Извештавање о коришћеној аналитичкој методи

Коришћена аналитичка метода наводи се у извештају о анализи.

4.3.5. Извештавање о резултатима анализе

Резултат анализе приказује се на начин утврђен аналитичком методом, са примереним бројем значајних чињеница, а према потреби се коригује с обзиром на удео воде у коначном узорку пре припреме.

4.3.6. Несигурност мерења и степен искоришћења при анализи непожељних супстанци

У вези с непожељним супстанцама, сматра се да производ намењен за храну за животиње није у складу с највећом допуштеном количином ако је резултат анализе, у односу на храну за животиње с уделом воде од 12%, већи од највеће допуштене количине, узимајући у обзир проширену несигурност мерења и корекцију за искоришћење. За оцену усклађености користи се анализирана концентрација након корекције за искоришћење и након одузимања проширене несигурности мерења. Тај се поступак примењује само у случајевима када аналитичка метода омогућује процену несигурности мерења и корекцију за искоришћење (нпр. није могуће у случају микроскопске анализе).

Резултати анализе исказују се на следећи начин (ако коришћена аналитичка метода омогућује оцену несигурности мерења и корекцију за искоришћење):

1) са корекцијом за искоришћење, при чему се наводи ниво искоришћења. Корекција за искоришћење није потребна ако је проценат искоришћења између 90% и 110%,

2) као‚ x +/– U’, при чему је x резултат анализе, а U проширена несигурност мерења уз употребу обухватног фактора 2, чиме се постиже ниво поузданости од приближно 95%.

Међутим, ако је резултат анализе знатно нижи (> 50%) од спецификације која се контролише и под условом да су коришћени примерени поступци за осигурање квалитета, а сврха анализе је само провера усклађености са законским одредбама, резултат анализе може се исказати без корекције за искоришћење и у тим случајевима се корекција за искоришћење и несигурност мерења могу изоставити.

ПРИЛОГ 3.

ОЗНАЧАВАЊЕ ПРЕРАЂЕНИХ ПРОТЕИНА ЖИВОТИЊСКОГ ПОРЕКЛА ОД ИНСЕКАТА ИЗ УЗГОЈА, СВИЊА ИЛИ ЖИВИНЕ, КАО И СМЕША КОЈЕ САДРЖЕ ТЕ ПРЕРАЂЕНЕ ПРОТЕИНЕ ЖИВОТИЊСКОГ ПОРЕКЛА

На међународној ветеринарској потврди или комерцијалном документу који прати пошиљку прерађених протеина животињског порекла од узгајаних инсеката, свиња или живине, као и на декларацији тих прерађених прерађених протеина животињског порекла од инсеката из узгоја, свиња или живине треба да буде јасно означено: „Прерађени протеини животињског порекла добијени од... [унети одговарајуће животиње из узгоја од којих су добијени прерађени протеини животињског порекла, а наведене су у првој колони Табеле] – не смеју да се употребљавају у храни за животиње намењене животињама из узгоја осим... [унети одговарајуће животиње из узгоја које смеју да се хране прерађеним протеинима животињског порекла, а навдене су у другој колони Табеле]”;

На декларацији смеша које садрже прерађене протеине животињског порекла добијене инсеката из узгоја, свиња или живине треба да буде јасно означено: „садржи прерађене протеине животињског порекла добијене од... [унети одговарајуће животиње из узгоја од којих су добијени прерађени протеини животињског порекла, а наведене су у првој колони Табеле] – није за исхрану животиња из узгоја осим... [унети одговарајуће животиње из узгоја које смеју да се хране прерађеним протеинима животињског порекла, а навдене су у другој колони Табеле]”.

Табела