Cl, Ca, Mg i MgCl2.
ODREĐIVANjE JONA SO42- - GRAVIMETRIJSKA METODA
Princip
Princip se zasniva na taloženju sulfatnih jona u rastvoru hlorovodonične kiseline kao barijum-sulfata, koji se i žari i meri.
Reagensi
Za određivanje jona SO42- koristi se sledeći reagensi:
: 91;1:- 38%-na hlorovodonična kiselina ((ro) = 1,19 g/ml);
- rastvor barijum-hlorida: odmeri se 122 g BaCl2 dž 2H2O i rastvori u 1000 ml vode.
Određivanje
Rastvori se 5 g uzorka za ispitvanje u 100 ml destilovane vode, kojoj je dodato nekoliko mililitara hlorovodonične kiseline. Sve se zagreje do ključanja i doda topli rastvor barijum-hlorida u malom višku, pa se ostavi nekoliko sati da se staloži. Tada se profiltrira krozgust filtrir-papir, ispere vrućom destilovanom vodom dok se išćezne rekcija na Cl-, osuši u lončiću. žari na temperaturi 600oC, ohladi u eksikatoru i meri:
procent SO42- = 8,231 . a;
procent SO3 = 6,86 . a;
gde je:
a - sadržaj lončića, u gramima.
ODREĐIVANjE JONA HLORA
Posle određivanja materija nerastvorljivih u vodi, iz svake merne boce otpipetira se po 10 ml filtrata u konične tikvice zapremine 300 ml i dopuni destilovanom vodom do 100 ml, doda 6 - 7 kapi 5%-nog rastvora K2CRO4 i titrira se 0,1 mol (AgNO3) 1 do prve najmanje promene boje.
Količina hlora izražava se u procentima i izračunava po sledećoj formuli:
(b . 50 . 0,35457) / a
gde je:
a - masa izmerene soli, u gramima;
b - utrošak 0,1 mol (AgNO3)/l, u mililitrima.
IZRAČUNAVANjE NATRIJUM-HLORIDA
Količina NaCl izražava se u procentima i izračunava se po sledećoj formuli:
5,845 . a
gde je:
a - broj utrošenih mililitara rastvora AgNO3 za titraciju.
ODREĐIVANjE MAGNEZIJUM-HLORIDA
Princip
Metoda se zasniva na ekstrakciji uzorka za ispitivanje etanolom i titraciji dinatrijum-etilen-diamin-tetrasirćetnom kiselinom (kompleksom III).
Reagensi
Za određivanje magnezijum-hlorida koriste se sledeći reagensi:
1) etanol 96%-ni;
2) rastvori za titraciju;
a) rastvor natrijum-hidroksida c(NaOH) = 1 mol/l;
b) 0,1%-ni vodeni rastvor metil-oranža;
v) rastvor hlorovodonične kiseline c(HCl) = 0,1 mol/l;
g) rastvor dinatrijum-etilen-diamin-tetrasirćetne kiseline c = 0,05 mol/l (EDTA);
d) puferni rastvor pH = 10 (54 g NH4Cl + 350 ml 25%-nog rastvora NH4OH dopuni se destilovanom vodom do 1000 ml);
đ) eriohrom-crno T: fino se isitni 1 g eriohrom-crnog sa 100 g NaCl.
Određivanje
Odmeri se 10 g uzorka, stavi u bocu zapremine 200 ml, doda se 50 ml etanola, zatvori i mućka 10 min, a zatim se filtrira. Pipetom se prenese 25 ml filtrata u koničnu tikvicu, doda se 70 ml destilovane vode, 5 ml pufernog rastvora i oko 0,3 g smeše indikatora i titrira rastvorom kompleksna III do promene boje u plavo.
Izračunavanje
Količina MgCl2 izražava se u procentima i izračunava po sledećoj formuli:
0,09253 . a
gde je:
a - broj mililitara rastvora utrošenog pri titraciji kompleksnom III.
ODREĐIVANjE KALCIJUMA
Posle određivanja materija nerastvorljivih u vodi, od filtrata se otpipetira 50 ml u koničnu tikvicu zapremine 300 ml. Posle dodavanje 10 - 15 ml 0,1 mol (NaOH)/l i indikatora (mureksid i NaCl u odnosu 1 : 250), titrira se sa 0,01 mol/l kompleksona III do promene boje iz ružičaste u ljubičastu.
Količina Ca izražava se u procentima i izračunava po sledećoj formuli:
Ca = (0,04 . b . 100) / a
gde je:
a - količina ispitivane soli, u gramima;
b - broj mililitra rastvora utrošenog za titraciju.
ODREĐIVANjE MAGNEZIJUMA
Posle određivanje materija nerastvorljivih u vodi, od filtrata se otpipetira 50 ml u koničnu tikvicu zapremine 300 ml i zagreje do temperature 40oC, doda se 5 ml pufernog rastvora i indikator eriohrom-crno T. Posle toga se rastvor, čija je pH vrednost 10, titrira rastvorom 0,01 mol (kompleksom III/l) do promene boje u svetloplavu.
Količina Mg izražava se u procentima i izračunava po sledećoj formuli:
((c - b) 1,22) / a
gde je:
a - količina ispitivane soli, u gramima;
b - utrošak rastvora za titraciju Ca, u mililitrima;
c - utrošak rastvora za titraciju Ca + Mg, u mililitrima.
26. ODREĐIVANjE NATRIJUMA I KALIJUMA
Princip se zasniva na određivanju natrijuma i kalijuma pomoću plamenog fotometra. Metoda za određivanje kalijuma i natrijuma primenjuje se za stočna hraniva, hranljive dodatke i krmne smeše.
Pripremanje rastvora uzorka za fotometrisanje
Odmeri se oko 1 g uzorka, navlaži sumpornom kiselinom (razblaženom 1 + 10), osuši na električnoj ploči i žari na temperaturi od približno 500oC do potpune razgradnje organske materije. Ostatak se rastvori kuvanjem sa 2 do 5 ml hlorovodonične kiseline na vodenom kupatilu, uz dodavanje 50 ml vode. Sadržaj posude prebaci se u čašu, zagreje do ključanja i amonijak dodaje do potpunog taloženja gvožđa, aluminijuma i fosfata. U rastvoru mora biti amonijak u neznatnom višku (miris). Neposredno posle toga vrši se filtriranje, pa se talog ispere vrućom vodom. Talog se, kad ga ima u većim količinama, rastvori u što manje hlorovodonične kiseline, ponovo taloži sa amonijakom i dobijeni talog ispira vrućom vodom. Sjedinjeni filtrati (ako je potrebno) upare se na manju zapreminu, prespu u mernu bocu i dopune vodom do oznake. U rastvoru se nalaze ukupne količine kalijuma i natrijuma.
Određivanje
ODREĐIVANjE KALIJUMA
Emisioni intenzitet kalijumovog spektra određuje se monohromatorom na 768 nm (nanometara) ili upotrebom nekih standardnih filtara, u plamenu acetilena i vazduha ili kiseonika, ili vodonika i kiseonika. Rastvor uzorka pripremljen na taj način stavi se u raspršivač instrumenta, pa se na galvanometru odredi skretanje kazaljke koje treba da se nađe u granicama određenim baždarnom krivom. U protivnom, potrebno je da se rastvor razblaži. Baždarna kriva određuje se na taj način što se 1,5829 g kalijum-hlorida (sušenog na temperaturi 500oC) rastvori u 1000 ml vode (1 ml rastvora sadrži 1 mg K2O), pa se od tog rastvora uzme, prema očekivanom sadržaju kalijuma u uzorku: 10, 20 ml itd. i razblaži vodom do 1000 ml. Tako dobijenim rastvorima odredi se plamen-fotometrom intenzitet skretanja galvanometra za talasnu dužinu od 768 nm. Dobijene vrednosti za baždarnu krivu (propustljivost) nanesu se na milimetarski papir, i to: na ordinatu-fotometrijske vrednosti, a na apscisu-odgovarajuće koncentracije standardnih rastvora kao K2O, u (mikro)g/ml. Kroz tako dobijene tačke provuče se baždarna kriva. Iz veličine fotometrijske vrednosti uzorka, a pomoću baždarne krive, odredi se sadržaj K2O u uzorku K = 0,83013 K2O.
ODREĐIVANjE NATRIJUMA
Emisioni intenzitet natrijumovog spektra određuje se monohromatorom na talasnoj dužini 589,3 nm ili korišćenjem nekih standardnih filtara: u plamenu acetilena i vazduha ili kiseonika, gasa ili vazduha ili kiseonika, ili vodonika i kiseonika. Rastvor uzorka, pripremljen kao za određivanje kalijuma, stavi se u raspršivač, pa se na galvanometru instrumenta odredi skretanje kazaljke, koje treba da bude u granicama određenim baždarnom krivom.
Baždarna kriva se određuje na taj način što se 1,8858 natrijum-hlorida, koji je sušen na 180oC, rastvori u 1000 ml vode (1 ml rastvora sadrži 1 mg N2O), pa se od tog rastvora uzme, prema očekivanom sadržaju natrijuma u uzorku: 10,20,30 ml itd. i razblaži vodom do 1000 ml. U tako dobijenim rastvorima odredi se plamen-fotometrom intenzitet skretanja za talasnu dužinu od 589,3 nm. Dobijene vrednosti za baždarnu krivu nanesu se na milimetarski papir, i to: na ordinatu - fotometrijske vrednosti, a na apscisu - odgovarajuće koncentracije standardnih rastvora kao N2O u (mikro)g/ml. Kroz tako dobijene tačke povuče se baždarna kriva. Iz veličine fotometrijske vrednosti uzorka, pomoću baždarne krive odredi se sadržaj N2O u uzorku: Na = 0,74191 N2O.
27. ODREĐIVANjE KALCIJUMA - KOMPLEKSOMETRIJSKA METODA
Princip i primena
Metoda se može primenjivati za određivanje kalcijuma u stočnoj hrani: stočnim smešama, kabastoj hrani, koncentratima i sirovinama za smeše.
Posle spaljivanja uzorka, dobijeni pepeo se rastvori i alikvotni deo tretira se dinatrijumovom soli etilen-diamin-tetrasirćetne kiseline (EDTA), uz prisustvo smeše indikatora (kalceina i timolftaleina). Da bi se postigla bolja indikacija ekvivalentne tačke, u prvom se stepenu dodaje višak EDTA, koji se retitrira rastvorom kalcijuma.
Reagensi
Koriste se sledeći reagensi, čistoće pro analysi:
1) rastvor natrijum-hidroksida c(NaOH) = 1 mol/l (40 g NaOH rastvori se u 1000 ml vode);
2) rastvor dinatrijumove soli etilen-diamin-tetrasirćetne kiseline;
a) rastvor dinatrijumove soli etilen-diamin-tetrasirćetne kiseline c(EDTA) = 0,1 mol/l (rastvori se 37,221 g EDTA u vodi, kvantitativno se prenese u odmernu tikvicu zapremine 1000 ml i dopuni vodom do oznake). Taj rastvor se najbolje čuva u polietilenskoj boci, i to na tamnom mestu; rastvor dinatrijumove soli etilen-damin-tetrasirćetne kiseline
b) c(EDTA) = 0,01 mol/l (200 ml 0,1 mol/l rastvora EDTA razblaži se sa 1800 ml čiste vode, dobro izmeša i upotrebi za titraciju. Koncentracija rastvora se svakodnevno kontroliše prilikom upotrebe);
3) rastvor kalcijuma za retitraciju:
a) primenjuje se standardni rastvor za određivanje tvrdoće vode, titrival (1 ml = 1 mg CaO po razblaženju na 1 l) i razblaži se destilovanom vodom do 2000 ml, pri čemu se dobije rastvor 0,008915 mol/l, ili
b) odmeri se tačno 17,846 g suvog kalcijum-karbonata, kvantitativno prenese sa destilovanom vodom u odmernu tikvicu zapremine 1 l, pažljivo se dodaje toliko 25%-ne hlorovodonične kiseline koliko je potrebno da prestane izlučivanje ugljen-dioksida, a zatim istom vodom dopuni do oznake. Rastvor se čuva u dobro zatvorenoj staklenoj boci i služi za pripremanje radnog rastvora. Odmeri se tačno 50 ml tog rastvora, prenese u odmernu bocu zapremine 1 l i dopuni vodom do oznake. Koncentracija tako razblaženog rastvora iznosi 0,008915 mol/l;
4) indikatorska mešavina: odmeri se 0,2 g kalceina, 0,12 g timolftaleina i 20 g kalijum-nitrata pa se u tarioniku dobro izmeša i isitni. Čuva se u dobro zatvorenoj boci na suvom mestu (najbolje u eksikatoru
5) kalijum-nitrat;
6) 25%-ni rastvor hlorovodonične kiseline.
Aparati i pribor
Osim uobičajene laboratorijske opreme, koristi se i:
1) staklena čaša, zapremine 250 ml;
2) automatske staklena bireta, zapremine 25 ml i 50 ml;
3) magnetna mešalica:
4) stona lampa, jačine 60 - 100 Nj;
5) pipeta trbušasta, zapremine 1 ml; 2 ml; 20 ml i 50 ml;
6) filtrir-papir (bela traka).
Određivanje
Odmerena količina uzorka žari se na temperaturi od 540 do 600oC. Uzorke koji ne sadrže organske materije nije potrebno žariti, već samo odmeriti i rastvoriti u kiselini. Pripremljeni pepeo od stočne hrane navlaži se vodom i u lončić zapremine 5 ml dodaje se 25%-ne hlorovodonične kiseline, a zatim se tretira na vrelom vodenom kupatilu da hlorovodonična kiselina ispari. Ponovo se doda 2 ml hlorovodonične kiseline, a nekoliko minuta kasnije i destilovana voda (malo više od polovine) i ostavi se na kupatilu samo toliko da se rastvor zagreje, a da ne ispari.
Rastvor se zatim, preko levka s filtrir-papirom, kvantitativno prenese u odmernu tikvicu zapremine 100 ml i do oznake dopuni destilovanom vodom.
Alikvotan deo rastvora pepela (a), koji sadrži 2 do 8 mg Ca, odmeri se trbušastom pipetom u čašu za titraciju na magnetnoj mešalici. Zatim se doda oko 50 mg indikatorske mešavine, 5 ml 1 mol/l rastvora natrijum-hidroksida i destilovane vode do približno 80 ml. Posle toga rastvor treba da bude ljubičaste boje, sa tamnozelenom fluorescencijom. Ako je rastvor žutozelene boje, ponovo se dodaje 5 ml natrijum-hidroksida.
Uz intenzivno mešanje magnetnom mešalicom dodaje se iz birete 0,01 mol/l rastvora EDTA sve dok se ne izgubi zelena fluorescencija i dok se ne intenzivira boja osnovnog rastvora. Dozira se višak EDTA od najmanje 5 ml, sačeka najmanje pola minuta, a zatim se višak EDTA retitrira sa 0,008915 mol/l rastvora kalcijuma, sve dok se ne pojavi zelena fluorescencija (osnovna ljubičasta boja izbledi). Ako se rastvor pretitrira, ponovo se dodaje EDTA, pa se ekvivalentna tačka može veoma tačno odrediti. Na kraju se zapiše količina utrošenog EDTA (V1) i rastvora kalcijuma (V2) u mililitrima.
Koncentracija EDTA kontroliše se tako što se u čašu odmeri 60 ml destilovane vode, indikator i 5 ml NaOH. Iz birete se dozira oko 15 ml EDTA, pa se zatim titrira rastvorom kalcijuma do pojave zelene fluorescencije. Količina utrošenog EDTA (V1) i rastvor kalcijuma (V2), u mililitrima, zapiše se pa se izračunava potrošnja EDTA na 1 ml rastvora kalcijuma. Taj faktor određuje se u tri ponavljanja, sa tačnošću na četvrtoj decimali.
Izračunavanje
Količina kalcijuma izražava se u procentima i izračunava se po sledećoj formuli:
(V1 - V2 . f) . (3,5731 / f) . a . m
: 91;0:gde je:
: 91;0:V1 - utrošen rastvor 0,01 mol/l EDTA za titraciju uzorka, u mililitrima;
V2 - utrošen rastvor 0,008915 mol/l rastvora Ca za retitraciju, u mililitrima;
f = V1 / V2 - faktor koji predstavlja potrošnju EDTA u mililitrima na 1 ml rastvora kalcijuma pri određivanju koncentracije EDTA;
a - odmereni broj mililitara rastvora uzorka uzetog za titraciju;
m - masa uzorka za pripremanje pepela, u gramima.
Ponovljivost
Određivanje se vrši u dve paralelne probe. Razlika između rezultata dva paralelna određivanja ili ubrzo jednog za drugim iznosi 3% a za kabastu stočnu hranu najviše 5%.
Napomena. Ako se za utvrđivanje pepela koristi 3 g uzorka, pri određivanju kalcijuma za pojedine vrste stočne hrane uzima se sledeći alikvot (a) za titraciju:
kukuruz i silaža 30 do 50 ml;
seno, trava 20 do 30 ml;
smeša 10 ml;
smeše za nosilje 5 do 10 ml;
mesno brašno 5 do 20 ml;
riblje brašno 2 do 5 ml;
koštano mesno brašno 1 do 3 ml.
Ekvivalentna tačka najbolje se uočava ako se titracija izvodi u tamnom delu laboratorije, na crnoj pozadini, uz konstantno direktno osvetljenje rastvora stonom lampom jačine 60 Nj do 100 Nj.
Napomena. Prilikom titracije uzorka, rastvor EDTA dodaje se u višku od najmanje 5 ml, a zatim se do retitracije sačeka najmanje pola minuta da bi se obavila reakcija Ca u prisustvu fosfora. Ako se u to vreme ponovo javi zelena fluorescencija, doda se još najmanje 5 ml EDTA.
28. ODREĐIVANjE MAGNEZIJUMA
Primena
Metoda za određivanje sadržaja magnezijuma primenjuje se za ispitivanje stočne hrane.
Određivanje
Izmeri se 1 do 5 g uzorka u platinski ili porculanski lončić i žari na temperaturi od približno 500oC, sve dok boja pepela ne postane bela do sivobela. Posle žarenja, pepeo se rastvori sa 5 do 10 ml hlorovodonične kiseline, prokuva se i filtrira. Talog se ispere, a filtrat potpuno ispari na vodenom kupatilu i suši u termostatu 3 h na temperaturi 120oC. Posle toga se doda 2 ml hlorovodonične kiseline i 50 ml vruće vode, prokuva se i filtrira. Talog se pere vrućom vodom. Filtrat se neutrališe amonijakom (1 + 1), pri čemu nastaje pahuljasti talog hidroksida gvožđa, aluminijuma, kalcijuma, magnezijuma i fosfata. Talog može izostati ako se pomenuti elementi nalaze u manjim količinama. Potrebna količina amonijaka određuje se po mirisu ili dodavanjem indikatora (metil-crveno).
U neutralisani rastvor doda se 1 ml, (razblažene 1 + 1) sirćetne kiseline (kalcijum i magnezijum fosfat se rastvaraju) i 5 g natrijum-acetata ili amonijum-acetata. Rastvor se zagreje do temperature 80oC, pa se, ako je potrebno, dodaje kap po kap 10%-nog rastvora ferihlorida (FeCb). Potrebna količina ferihlorida određuje se promenom boje taloga koji nastaje dodavanjem ferihlorida u rastvor. Čim se počne stvarati crvenosmeđi talog, treba prestati sa dodavanjem ferihlorida i sva količina fosfata se odstrani.
Posle nekoliko minuta talog se odstrani filtriranjem preko filtrir-papira, pa se talog pere vrućim rastvorom amonijum-acetata. U bistar filtrat doda se 10 ml zasićenog rastvora amonijum-oksalata ((NH4)2C2O4) i 1 do 2 kapi indikatora (metil-crveno). Filtrat se zagreje skoro do ključanja i postepeno neutrališe amonijakom, dok crvena boja indikatora ne pređe u žutu boju. Posle toga ostavi se 4 h na vrućem vodenom kupatilu, a zatim se izdvojeni talog filtrira. Talog i filtrat se isperu vrućom vodom.
Filtrat i voda, posle pranja taloga, potpuno se upare uz dodavanje 3 ml azotne kiseline, pa se zatim amonijačne pare odstrane opreznim zagrevanjem. Ostatak se rastvori u 5 ml hlorovodonične kiseline i doda destilovana voda do približno 100 ml. Posle toga doda se 5 ml 10%-nog rastvora natrijum-citrata i 10 ml 10%-nog rastvora amonijum-fosfata ((NH4)2HPO4) ili toliko da se sav magnezijum istaloži. Zatim se doliva amonijak (razblažen 1 + 4), uz stalno mešanje staklenim štapićem, dok rastvor ne postane alkalan i dok se ne počne stvarati talog amonijum-fosfata. Tada se naglo doda 25 ml amonijaka (1 + 4) i meša do potpunog taloženja magnezijuma. Talog se ostavi preko noći na hladnom, pa se zatim filtritra preko filtrir-papira. Dobijeni talog se ispere hladnim amonijakom (1 + 10) dok voda posle pranja ne počne da više reaguje na hloride. Talog se zatim žari na temperaturi od 900 do 1000oC, hladi u eksikatoru i meri kao magnezijum pirofosfat (Mg2P2O7).
Izračunavanje
Količina MgO izražava se u procentima izračunava se po sledećoj formuli:
(b . 0,36226 . 100) / m
gde je:
b - masa dobijenog taloga, u gramima;
m - masa ispitivanog uzorka, u gramima;
0,36226 - faktor za preračunavanje MgO iz Mg2P2O7.
29. ODREĐIVANjE UKUPNOG FOSFORA - SPEKTROFOTOMETRIJSKA METODA
Princip i primena
Metoda se primenjuje pri utvrđivanju ukupnog sadržaja fosfora za sve vrste stočne hrane.
Princip se zasniva na spaljivanju uzorka (kad je hrana organskog porekla) ili vlažnom spaljivanju (kad je hrana mineralnog porekla), zatim na rastvaranju u kiselom rastvoru. Rastvor se tretira molibden-vandatnim reagensom i apsorbancija dobijenog žutog rastvora meri se spektrofotometrom na talasnoj dužini od 430 nm.
Reagensi
Za određivanje sadržaja ukupnog fosfora potrebni su sledeći reagensi, čistoće pro analysi, i destilovana voda:
1) kalcijum-karbonat;
2) hlorovodonična kiselina c(HCl) = 6 mol/l;
3) azotna kiselina c(HNO3) = 1 mol/l;
4) azotna kiselina, (ro)20 = 1,38 g/ml;
5) sumporna kiselina, (ro)20 = 1,84 g/ml;
6) molibden-vanadatni reagens: u odmernu tikvicu zapremine 1 l promeša se 200 ml rastvora amonijum-heptomolibdata, 200 ml rastvora amonijum-monovanadata i 135 ml azotne kiseline ((ro)20 = 1,38 g/ml) i do oznake dopuni destilovanom vodom;
7) rastvor amonijum-heptomolibdata: u vrućoj destilovanoj vodi rastvori se 100 g heptomolibdat-tetrahidrata (NH4)6MO7O24 dž 4H2O), doda 10 ml amonijum hidroksida (p20 = 0,91 g/ml) i do 1 l dopuni destilovanom vodom;
8) rastvor amonijum-monovanadata: u 400 ml vruće vode rastvori se 2,35 g amonijum-monovanadata (NH4VO3), zatim se uz stalno mešanje postepeno dodaje 20 ml razblažene azotne kiseline (7 ml azotne kiseline ((ro)20 = 1,38 g/ml) + 13 ml destilovane vode) i dopuni destilovanom vodom do 1 l;
9) standardni rastvor fosfora koji sadrži 1 mg fosfora/ml: u odmernoj tikvici zapremine 1 l rastvori se u destilovanoj vodi 4,367 g kalijum-dihidrogen-fosfata (KH2PO4) i do oznake dopuni destilovanom vodom.
Aparatura i pribor
Pored uobičajene laboratorijske opreme, potreban je i sledeći pribor:
1) lončić za žarenje od porculane ili kvarca;
2) električna mufolna peć sa regulacijom na 550 +- 20oC;
3) kjeldal-tikvica, zapremine 250 ml;
4) odmerne tikvice, zapremine 500 i 1000 ml;
5) pipete, graduisane;
6) spektrofotometar sa kivetama, zapremine 1 mm;
7) staklene cevi, kapaciteta od 25 do 30 ml, snabdevene staklenim zapušačima;
8) analitička vaga;
9) peščano kupatilo;
10) čaša, zapremine 250 ml.
Određivanje
Pripremanje rastvora za ispitivanje
Zavisno od prirode uzorka, rastvor za ispitivanje priprema se prema niže navedenim uslovima (suvo spaljivanje uzorka ili vlažno spaljivanje).
Suvo spaljivanje uzorka (za uzorke koji sadrže organsku materiju i od kojih se posle spaljivanja do suvog dobija nerastvorljivi ostatak)
U lončić za žarenje izmeri se oko 2,5 g uzorka, sa tačnošću od 0,001 g. Odmerena količina uzorka dobro se izmeša sa 1 g kalcijum-karbonata i spaljuje u mufolnoj peći na temperaturi 550 +- 20oC sve dok se ne dobije beli ili sivi pepeo.
Pepeo se prenese u čašu zapremine 250 ml, doda se 20 ml vode i hlorovodonične kiseline do potpune neutralizacije. Zatim se doda još 10 ml 6 mol/l hlorovodonične kiseline, a čaša se stavi na peščano kupatilo i isparava do suvog ostatka da bi se dobio nerastvorljiv pesak. Zatim se ostavi da se hladi. Ostatku se doda 10 ml mol/1 l azotne kiseline i stavi na peščano kupatilo da ključa 5 min. Tečnost se dekantuje u odmernu tikvicu zapremine 500 ml pri čemu se čaša više puta, ispira vrućom vodom ostavi da se ohladi, dopuni vodom do oznake, promeša i filtrira.
Vlažno spaljivanje uzorka (za uzorke mineralnog porekla i uzorke u tečnom stanju)
Izmeri se 1 g uzorka za ispitivanje, sa tačnošću od 0,001 g, i prenese u kjeldal-tikvicu zapremine 250 ml, doda 20 ml sumporne kiseline i promućka tako da uzorak potpuno prekrije kiselina i da se spreči lepljenje za zidove tikvice. Tikvica sa sadržajem zagreva se do ključanja i sadržaj ključa 10 min. Zatim se ostavi da se postepeno hladi, doda se 2 ml azotne kiseline ((ro)20 = 1,38 g/ml) i postepeno zagreva, ponovo postepeno hladi i doda malo azotne kiseline ((ro)20 = 1,38 g/ml), pa se tako zagreva do ključanja.
Taj postupak se ponavlja sve dok se ne dobije obezbojen rastvor.
Rastvor se ohladi, doda malo destilovane vode i tečnost dekantacijom prenese u odmernu posudu zapremine 500 ml, pri čemu se kjeldal-tikvica ispira vrućom destilovanom vodom.
Rastvor se u odmernoj tikvici ohladi, zatim se do oznake dopuni destilovanom vodom, promućka i filtrira.
Razvijanje boje i merenje apsorbancije
Uzme se alikvotni deo filtrata dobijen postupkom pripremanja rastvori za ispitivanje da bi se dobila koncentracija fosfora najviše do 40 (mikro)g/ml.
10 ml ovog rastvora prenese se u cev za određivanje i doda 10 ml molibden-vanadatnog reagensa, promućka i ostavi 10 min na sobnoj temperaturi. Zatim se na spektrofotometru meri apsorbancija obojenog rastvora na talasnoj dužini do 430 nm, u odnosu na slepu probu.
Napomena. Na istom uzorku vrše se sva određivanja.
Pripremanje standardne krive
Za pripremanje standardne krive koriste se standardni rastvori fosfora, koji se dalje pripremaju tako da sadrže 5; 20; 30; i 40 (mikro)g fosfora/ml.
Od svakog rastvora uzme se 10 ml i svakome doda 10 ml molibden-vanadatnog reagensa, rastvori se promućkaju i ostave najmanje 10 min na sobnoj temperaturi, a zatim se apsorbancije mere spektrofotometrijski.
Nacrta se standardna kriva, pri čemu se vrednost apsorbancije nanosi na ordinatu, a na apscisu - odgovarajuće koncentracije fosfora (mikro)g/ml.
Slepa proba
Paralelno sa određivanjem priprema se i slepa proba, pri čemu se primenjuje isti postupak i koriste iste količine svih reagensa, ali bez uzorka.
Izračunavanje
Sadržaj ukupnog fosfora izražava se u procentima mase i izračunava po sledećoj formuli:
(Dž . 500 . F . 100) / (m . 106) = (Dž . F) / (20 . m)
: 91;0:gde je:
: 91;0:Dž - sadržaj fosfora (mikro)g/ml, u razblaženom alikvotnom delu rastvora uzorka, pročitanom sa standardne krive;
m - masa uzorka koja je uzeta za pripremanje rastvora za ispitivanje, u gramima;
F - recipročan faktor razblaženja za alikvotan deo u postupku razbijanja boje i merenja apsorbancije.
Kao rezultat se uzima aritmetička sredina rezultata iz dva paralelna određivanja ako su zadovoljeni uslovi ponovljivosti.
Rezultat se ne sme razlikovati više od:
0,01% (m/m) fosfora - za sadržaj fosfora manji od 3% (m/m);
0,1% (m/m) fosfora - za sadržaj fosfora jednak ili veći od 3% (m/m).
Ponovljivost
Razlika između rezultata dva paralelna određivanja koja je istovremeno ili neposredno jedno za drugim izveo isti analitičar ne sme biti veća od:
3% (relativna vrednost) - za sadržaj fosfora jednak 5% ili veći od 5% (m/m);
0,15% (apsolutna vrednost) - za sadržaj fosfora jednak 5% ili veći od 5% (m/m).
30. ODREĐIVANjE SUMPORA
Princip i primena
Princip se zasniva na određivanju sumpora oksidacijom ispitivanog uzorka magnezijum-nitratom.
Metoda za određivanje sumpora primenjuje se pri ispitivanju stočnih hraniva, hranljivih dodataka i krmnih smeša.
Reagensi
Za određivanje sadržaja sumpora potrebni su sledeći reagensi:
1) rastvor magnezijum-nitrata: odmeri se 15 MgO i doda 85 g HNO3, a zatim razblaži vodom u odnosu 1 : 1;
2) koncentrovana hlorovodonična kiselina;
3) 10%-ni rastvor barijum-hlorida.
Aparatura i pribor
Pored uobičajene laboratorijske opreme, koristi se i:
1) porculanski lončić;
2) vodeno kupatilo;
3) peć za žarenje;
4) staklena čaša, zapremine 250 ml;
5) merna boca, zapremine 250 ml.
Pripremanje uzorka
Odmeri se 1 g uzorka u porculanskom lončiću, doda se 7,5 ml rastvora magnezijum-nitrata i dobro promeša. Porculanski lončić sa uzorkom stavi se na vodeno kupatilo i dodaje kap po kap hlorovodonične kiseline dok se reakcija ne završi, pa se topli lončić prebaci u hladnu peć za žarenje i postepeno zagreva do temperature 500oC, do potpune oksidacije organske materije uzorka. Lončić se zatim izvadi iz peći i ostavi da se ohladi, a sadržaj se prebaci u čašu zapremine 250 ml i doda dovoljna količina vode i hlorovodonične kiseline u malom višku. Rastvor se zagreje do ključanja i filtrira, a talog se dobro ispere. Filtrat se prebaci u mernu bocu zapremine 250 ml, dopuni vodom do oznake, pa se u alikvotnom delu odredi sumpor kao što je navedeno u postupku određivanja.
Određivanje
U alikvotnom delu filtrata (10 do 200 ml) određuje se sumpor taloženjem. Alikvotni deo se otpipetira u čašu i doda vode do 200 ml, a zatim i toliko hlorovodonične kiseline da u rastvoru bude još oko 0,5 ml slobodne hlorovodonične kiseline. Zatim se zagreva do ključanja i doda 10 ml 10%-nog rastvora barijum-hlorida, uz konstantno mešanje. Kuvanje se nastavlja još 5 min, pa se ostavi 5 h ili duže da se taloži na vodenom kupatilu. Talog barijum-sulfata (BaSO4) filtrira se preko gustog filtrir-papira i ispira vrućom vodom sve dok posle ispiranja taloga voda ne prestane da pokazuje reakciju na hloride. Talog se zatim prebaci u žareni i izmereni porculanski lončić, suši se, žari se na što nižoj temperaturi, hladi se u eksikatoru i ponovo meri kao BaSO4.
Izračunavanje
Količina sumpora izražava se u procentima i izračunava po sledećoj formuli:
(b . 0,1374 / m) . 100
gde je:
m - masa ispitivanog uzorka, u gramima;
b - masa BaSO4, u gramima.
31. ODREĐIVANjE HLORA
Princip i primena
Za određivanje hlora primenjuju se dva postupka, i to: za određivanje ukupnog hlora - gravimetrijska metoda, a za određivanje rastvorljivog hlora - titrimetrijska metoda.
Postupci određivanja hlora primenjuju se pri određivanju hlora u stočnom hranivima, hranljivim dodacima i krmnim smešama.
ODREĐIVANjE UKUPNOG HLORA
Određivanje
Odmeri se 5 g uzorka za ispitivanje u platinskom lončiću, navlaži se sa 20 ml 5%-nog rastvora natrijum- karbonata, upari do suvog i žari na što nižoj temperaturi, oko 500oC. Pepeo bele do sivobele boje ekstrahuje se vrućom vodom, filtrira i pere. Ako preostane veća količina nerastvorljivog pepela, onda se pepeo, zajedno sa filtrir-papirom, ponovo vrati u platinski lončić i žari na istoj temperaturi. Pepeo se rastvara u nekoliko mililitara azotne kiseline (1 + 4), filtracijom odvaja od nerastvorljivog dela, pere i doda vodenom ekstraktu.
U rastvor azotne kiseline doda se 10%-nog rastvora AgNO3 u malom višku. Rastvor se zagreje do ključanja, ostavi na tamnom mestu do potpune koagulacije taloga (AgCl) i filtrira preko lončića za filtriranje, a talog se pere vrućom vodom do uklanjanja viška AgNO3. Talog AgCl suši se na temperaturi od 140 do 150oC, hladi se i meri.
Izračunavanje
Količina ukupnog hlora izražava se u procentima i izračunava po sledećoj formuli:
(0,24737 b / m) . 100
gde je:
m - masa ispitivanog uzorka, u gramima;
b - masa nađenog AgCl, u gramima.
ODREĐIVANjE RASTVORLjIVOG HLORA
Reagensi
Za određivanje sadržaja hlora potrebni su sledeći reagensi:
1) rastvor kalijum-hlorida: KCl suši se na temperaturi 500oC u peći za žarenje do konstantne mase, pa se 2,1026 g rastvori i razblaži vodom do 1000 ml; rastvor sadrži 0,001 g Cl/ml;
2) rastvor srebro-nitrata: odmeri se 5 g AgNO3 i rastvori u 1000 ml vode i podesi se tako da 1 ml tog rastvora bude ekvivalentan 1 ml standardnog rastvora KCl (titracijom);
3) rastvor kalijum-rodanida: odmeri se 2,5 g KCNS, rastvori u 100 ml vode i podesi se tako da 1 ml tog rastvora odgovara 1 ml rastvora AgNO3; 40 do 50 ml rastvora srebro-nitrata titrira se uz indikator ferisulfat i 5 ml HNO3 (1 + 1) rastvorom rodanida, dok rastvor, posle jakog mućkanja, ne postane bledoružičast.
4) rastvor ferisulfata: odmeri se 6 g Fe2(SO4)3 . H2O i rastvori u destilovanoj vodi, pa se u mernoj boci doda vode do 100 ml;
5) rastvor indikatora ferisulfata: u 25%-ni rastvor ferisulfata Fe2(SO4)3 . H2O doda se jednaka zapremina HNO3.
Određivanje
U koničnu tikvicu zapremine 300 ml odmeri se 2 do 5 g uzorka za ispitivanje i pipetom doda 50 ml rastvora Fe2(SO4)3. Za vreme dodavanja ferisulfata rastvor se lagano meša da bi se sprečilo grudvanje uzorka i olakšalo rastvaranje hlorida. Zatim se pipetom doda 100 ml amonijaka (razblaženog 1 + 19) i ponovo lagano meša, jer se rastvor vrlo teško filtrira ako se mućka. Rastvor se ostavi 10 min da se staloži, a zatim se filtrira preko filtrir-papira male gustoće. U 50 ml alikvotnog dela u uzorku sa 0 do 2% Cl ili u 25 ml u uzorku sa više od 2% hlora, hlor se određuje titracijom. Ako ni približna količina hlora u uzorku nije poznata, treba uzeti 10 ml filtrata radi eksperimentalne titracije. U taj filtrat dodaje se 10 ml HNO3 + 10 ml Fe2(SO4)3 (kao indikator) i razblaži do 50 ml. Posle toga doda se 0,5 ml rastvora kalijum-rodanida (KCNS) i neposredno, uz mešanje, toliko rastvora AgNO3 da se eliminiše crvena obojenost. Iz te približne titracije odredi se približna zapremina rastvora srebro-nitrata za potpuno taloženje hlora. U alikvotnom delu, koji će se uzeti za titraciju, potreban je višak od približno 10% rastvora azotne kiseline, mada i malo veći dodatak ne utiče na rezultat. Potrebno je uzeti najmanje 10 ml rastvora AgNO3.
U alikvotni deo, u čašu zapremine 250 ml, doda se 10 ml rastvora srebro-nitrata i 10 ml rastvora srebro-nitrata i 10 ml ferisulfata kao indikatora. Zatim se uz mešanje doda izračunata zapremina rastvora srebro-nitrata, zagreje do ključanja i ostavi da se ohladi do sobne temperature, uz mešanje, da bi talog koagulirao. Višak srebro-nitrata titrira se kalijum-rodanidom. Završna tačka je indicirana pojavom crvene boje, koja je postojana 15 sekundi.
Jedan mililitar utrošenog rastvora 0,1 mol/l srebro-nitrata odgovara 1 ml hlora.
32. ODREĐIVANjE JODA
Primena
Metoda za određivanje joda primenjuje se za ispitivanje joda u stočnim hranivima, hranljivim dodacima i krmnim smešama.
Aparati i pribor
Osim uobičajene laboratorijske opreme, koristi se i:
1) peć za spaljivanje (sl. 5 u prilogu): od gvozdenog lima načini se cilindar (1), dimenzija datih na slici, sa otvorom na vrhu koji je toliko širok da se u njega može staviti nikleni lončić (2) zapremine 100 ml. Ispod vrha cilindra montira se okrugla limena ploča (3) koja sprečava gasove plamena da direktno ližu zidove niklenog lončića. Pri dnu cilindra načini se dug uzan otvor (4) kroz koji se stavlja plamenik. Neznatno ispod gornje ivice cilindra načini se na plaštu osam otvora (5) za slobodno ispuštanje gasova koji se stvaraju pri sagorevanju.
Reagensi
Za određivanje sadržaja joda potrebni su sledeći reagensi:
1) 20%-ni rastvor reducirane fosforne kiseline: nečistoće u fosfornoj kiselini, H3PO4, redukuju se razblaženjem 85%-ne kiseline sa četiri zapremine vode i kratkotrajnim kuvanjem sa aluminijumskim listićima;
2) c(Na2S2O3) = 0,005 mol/l rastvor natrijum, tiosulfata: u čašu zapremine 25 ml otpipetira se 25 ml rastvora koji sadrži 0,1300 g KJ/1000 ml, doda se 200 ml H2O, 5 ml 20%-nog rastvora NaHSO3 i 2 ili 3 g NaOH, neutrališe se sa H2PO4 i doda 1 ml u višku. Da bi se odredio broj miligrama joda koji je ekvivalentan sa dobijenim rastvorom Na2S2O3, primenjuje se sledeća formula:
f = 2,5 / (ml 0,05 mol/l rastvora Na2S2O3
Rastvor natrijum tiosulfata treba pripremiti istog dana kad se vrši određivanje joda u uzorku.
Određivanje
Odmeri se 20 g NaOH i 10 g KNO3 u niklenom lončiću, zajedno rastopi i zatim ohladi. Preko otopljene mase stavi se 1 do 10 g uzorka, koji se zatim navlaži sa 5 ml NaOH (1 + 1) i 10 ml 80%-nog etanola. Lončić se stavi na hladnu električnu ploču, na kojoj, postepenim zagrevanjem, etanol ispari. Temeljno zagrevanje mase potrebno je da bi se izbeglo naknadno isparavanje i gubitak joda. Lončić se zatim stavi u spremljenu peć za spaljivanje i oprezno zagrevanje. Ako reakcija postane suviše burna, lončić se ukloni iz peći i neko vreme ostavi da se ohladi, a zatim se nastavi da se oprezno zagreva. Kad se otopljena masa potpuno umiri, naginjanjem lončića pokupe se sa strane i one čestice uzorka koje nisu reagovale. U lončić se stavi nekoliko kristala KNO3 dok ne prestane dalje stvaranje gasova, a zatim se strane lončića isperu (naginjanjem lončića).
Lončić se na kraju izvuče iz peći, ohladi, stavi u čašu zapremine 600 ml i doda toliko vode da bude pokriven. Sadržaj lončića zagreva se kratko vreme, ali toliko da ne dođe do ključanja. Rastvor se ostavi preko noći, lončić se ispere i ukloni. Rastvor se neutrališe dodavanjem 10 ml koncentrovane H3PO4, ostavi 3 do 4 h na vodenom kupatilu, uz povremeno mešanje, da bi se jod potpuno rastvorio. Čaša se ohladi, nerastvoreni deo odstrani filtriranjem i talog ispere hladnom vodom. Zapremina filtrata u čaši zapremine 800 ml podesi se na približno 600 ml.
Rastvor treba da bude bezbojan i bistar.
Nitrati koji smetaju titraciji razaraju se sa 10 ml 20%-nog rastvora NaHSO3. Rastvor se prokuva, doda mu se iz birete oko 30 ml koncentrovanog rastvora H3PO4, takođe se doda nekoliko kapi metil-oranža, nastavi se dodavanje H3PO4 do neutralizacije i, najzad, doda 1,5 ml H3PO4 u višku. Ukupna potrebna količina H3PO4 malo je manja od 35 ml, izuzev kad se proces vodi tako da je KNO3 bio redukovan većim količinama organske supstancije u K2CO3. Višak kiseline treba izbegavati jer daje niske rezultate. Kiselinu treba dodavati relativno brzo, jer se boja metiloranža vremenom gubi s obzirom na nepotpunu razgradnju nitrata.
Posle neutralisanja zapremina se upari kuvanjem, koje traje 20 min. Zatim se doda malo bromne vode i kuva dok rastvor ne postane trajno žut, kuvanje se nastavi do bezbojnosti, a zatim se kuva još 5 min. U rastvor se zatim doda nekoliko kapi salicilne kiseline da bi se odstranili poslednji tragovi broma, rastvor se ohladi, doda se 5 ml 20%-nog redukovanog rastvora H3PO4 i 0,5 do 1 g KJ. Rastvor se titrira 0,005 mol/l rastvorom Na2S2O3, uz dodavanje rastvora skroba. Zapremina rastvora po završetku titriranja treba da iznosi 400 do 500 ml.
Izračunavanje
Količina joda izražava se u miligramima, a izračunava se po sledećoj formuli:
f . a
gde je:
f - faktor za preračunavanje 0,005 mol/l rastvora Na2S2O3 (ml) u jodu (mg);
a - broj utrošenih ml 0,005 mol/l rastvora Na2S2O3.
33. ODREĐIVANjE MIKROELEMENATA - SPEKTROFOTOMETRIJSKA METODA
Princip i primena
Za određivanje mikroelemenata: gvožđa, mangana, kobalta, cinka i bakra primenjuje se spektrofotometrijska metoda. To određivanje obavlja se za sve vrste stočne hrane.
Pripremanje uzorka
Pri uzimanju i sitnjenju uzorka za ispitivanje ne sme se koristiti oprema koja je po površini korozirala ili se naziru tragovi oštećenja.
Spaljivanje
Za određivanje mikroelemenata, uzorak za ispitivanje spaljuje se na temperaturi od 450 do 500oC, kako ne bi došlo do gubitaka ili do stvaranja nerastvorljivih jedinjenja sa kiseonikom iz vazduha ili sa zidovima posude u kojoj se vrši spaljivanje. Za spaljivanje se koriste platinske, kvarcne ili porculanske posude čija površina treba da bude glatka i glazirana.
Pripremanje rastvora za analizu
Odmeri se 10g uzorka za analizu i spaljuje na temperaturi 450 do 500oC dok se ne dobije ostatak bez ugljenika (3 do 6 h).
Završetak spaljivanja određuje se prema boji pepela. Ostatak se kvantitativno prenese u čašu zapremine 600 ml. Uzorci koji nisu organskog porekla ne spaljuju se. Čaša se poklopi sahatnim staklom i pažljivo se doda koncentrovana hlorovodonična kiselina. Pomoću staklenog štapića napravi se kaša i drži na vodenom kupatilu dok sva kiselina ne ispari. Eventualni ostatak kiseline ukloni se na peščanom kupatilu.
Dobijenom ostatku u čaši doda se 60 ml koncentrovane hlorovodonične kiseline i 300 ml vode, pa se zatim najmanje 30 min drži na ključalom vodenom kupatilu. Posle toga filtrira se preko gustog filtrir-papira u odmerni sud zapremine 500 ml. Čaša i filtrir-papir dobro se isperu vodom, a odmerni sud se do oznake dopuni vodom. Tako pripremljen rastvor koristi se za određivanje mikroelemenata.
34. ODREĐIVANjE MANGANA - SPEKTROFOTOMETRIJSKA METODA
Princip i primena
Metoda se zasniva na oksidaciji bezbojnog mangana Mn(II) u crvenoljubičasti obojeni mangan. Kao oksidaciono sredstvo koristi se perjodat ili persulfat, uz srebro-nitrat kao katalizator. Sumpornom i azotnom kiselinom odstranjuju se hloridi, redukujuće supstancije i male količine organske materije, a uticaj trovalentnog gvožđa odstranjuje se dodavanjem ortofosforne kiseline.
U mineralnim smešama u kojima su zastupljene velike količine hlorida koristi se perjodat kao oksidaciono sredstvo.
Reagensi
Za određivanje sadržaja mangana potrebni su sledeći reagensi:
1) standardni rastvor MnSO4H2O: rastvori se 0,3077 g MnSO4H2O u 0,1 mol (1/2 H2SO4)/l i do 1000 ml dopuni sumpornom kiselinom iste koncentracije: 1 ml = 0,1 mg Mn;
2) rastvor sumporne kiseline 5:100 (V/V).
U vrlo malim količinama mangana koncentracija sumporne kiseline treba da iznosi c(1/2 H2SO4) = 1 mol/l, a za veći sadržaj mangana - koncentracija sumporne kiseline c(1/2 H2SO4) = 1,75 mol/l;
3) koncentrovana sumporna kiselina ((ro) = 1,84 g/ml);
4) koncentrovana azotna kiselina ((ro) = 1,40 g/ml);
5) rastvor ortofosforne kiseline, 85%-ni;
6) kalijum-perjodat.
Napomena. Perjodat je pogodniji za određivanje mangana u mineralnim smešama. Nedostatak perosulfata je u tome što stvara talog i kalcijum-sulfat, a može eventualno stvoriti koloidni srebro-hlorid. Crvena boja nastala oksidacijom persulfata gubi se posle 24 sata, a boja nastala oksidacijom perjodata postojana je mesec dana.
Određivanje
U porculansku šolju odmeri se 25 do 100 ml rastvora pripremljenog za analizu (metoda 33 ovog pravilnika) - (sa sadržajem mangana 0,05 do 0,5 mg), doda se 2 ml koncentrovane sumporne kiseline i 1 ml koncentrovane azotne kiseline. Šolja se stavi na ključalo kupatilo da tečnost ispari i posle toga drži u sušnici na 140oC u toku jednog časa, dok se ne odstrani miris na kiseline.
Ostatku u šolji doda se 25 ml vode, zagreje se i filtrira kroz filtrir-papir u koničnu tikvicu zapremine 100 ml, a šolja i ostatak na filtrir-papiru tretiraju se sa 15 ml razblažene sumporne kiseline (5 : 100 V/V). Zatim se u koničnu tikvicu doda 2 ml 85%-ne ortofosforne kiseline i oko 0,5 g kalijum-perjodata, pa se sadržaj zagreva do ključanja. Konična tikvica, poklopljena sahatnim staklom, ostavi se 1 h na vodenom kupatilu koje intenzivno ključa. Posle hlađenja, rastvor se prenese u odmernu tikvicu zapremine 50 ml i vodom dopuni do marke. Dobro se promeša i boja meri na 525 nm u odnosu na slepu probu.
Standardna kriva priprema se od standardnog rastvora MnSO4H2O, čiji 1 ml sadrži 0,1 mg Mn. Uzima se 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 i 5,0 ml, prenese u koničnu tikvicu, doda 2 ml sumporne kiseline, oko 2 ml vode, 2 ml ortofosforne kiseline i dalje postupa kao što se postupa sa rastvorom kome se meri boja na 525 nm.
35. ODREĐIVANjE KOBALTA - SPEKTROFOTOMETRIJSKA METODA
Princip i primena
Kobalt gradi sa 2-nitrozo-1-naftolom crveno obojeni kompleks koji se rastvara u organskim rastvaračima. Višak reagensa se odstranjuje mućkanjem ekstrakta toluola razblaženim natrijum-hidroksidom koji ne utiče na kobalt-nitrozo-komplekse. Trovalentno gvožđe, koje sa 2-nitrozonaftolom gradi mrk talog, maskira se citratom. Mineralne smeše koje sadrže bakar, koji takođe daje reakciju s introzonaftolom, mogu se analizirati do odnosa kobalt - bakar 1 : 150.
Reagensi
Za određivanje sadržaja kobalta potrebni su sledeći reagensi:
1) standardni rastvor kobalta: rastvori se 0,4769 g CoSO4 . 7H2O u 0,1 mol (HCl)/l i dopuni kiselinom do 1000 ml (1 ml = 0,1 mg Co). Od tog rastvora otpipetira se 10 ml u odmorni sud zapremine 500 ml i dopuni rastvorom 0,1 mol (HCl)/l do oznake (1 ml = 2 (mikro)g Co);
2) 1%-ni rastvor 2-nitrozo-1-naftola u metanolu (m/V). Usled stajanja rastvora, do introzojedinjenja u prisustvu kiseonika iz vazduha prelazi u introjedinjenje i slepa proba daje visoke vrednosti, tako da pripremljeni rastvor uvek mora biti svež. Osim toga, trgovački preparat nije dovoljno čist i treba ga prečistiti na taj način što se 10 g preparata rastvori u 400 ml ključale vode, ostavi da se ohladi i istaloženi kristali suše u vakumu na temperaturi 70oC;
3) 50%-ni diamonijum-hidrogencitrat (m/V);
4) rastvor natrijum-hidroksida c(NaOH) = 2 mol/l;
5) toluol.
Određivanje
U tikvicu za jodni broj odmeri se 10 do 50 ml rastvora za analizu (metoda 33 ovog pravilnika), sa sadržajem CO do 50 (mikro)g, i doda vode do 50 ml. Rastvor se tretira sa 10 do 20 ml 50%-nog amonijumcitratnog rastvora, a pomoću rastvora 2 mol (NaOH)/l pH vrednost podesi na 6,7 do 6,8. Zatim se doda 1 ml 1%-nog introzonaftola i rastvor ostavi 90 min na tamnom mestu. Doda se 20 ml toluola i promućka, a suspenzija odmah prenese u levak za odvajanje i snažno mućka 5 min. Posle odvajanja faza, ispusti se vodeni sloj, čep i zidovi operu vodom, ispusti se voda, a zatim doda 25 ml rastvora 2 mol (NaOH)/l i promućka. Posle toga se ispusti natrijum-hidroksid, čep i zidovi ponovo operu vodom, voda se ispusti i ekstrakcija hidroksidom ponovi snažnim mućkanjem 5 min. Posle ispuštanja vodenog sloja uzima se ekstrakt toluola u kivetu dužine 2 cm spektrofotometriše u odnosu na slepu probu na 530 nm.
Za pripremanje standardne krive uzima se 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 15,0 i 20,0 ml standardnog rastvora, koji u mililitru sadrži 2 (mikro)g Co u tikvici za jodni broj, dopuni vodu do 50 ml i dalje postupa kao što je navedeno u postupku određivanja.
36. ODREĐIVANjE GVOŽĐA - SPEKTROFOTOMETRIJSKA METODA
Princip
U alikvotnom delu rastvora pripremljenog za analizu (metoda 33 ovog pravilnika) trovalentno gvožđe se prevede u dvovalentno pomoću hidroksilamin-hlorhidrata, rastvoru se, pomoću natrijuma-acetata, pH vrednost podesi na 3,5 i sa 1,10 - fenantrolinom nagradi kompleks crvene boje, koji se fotometriše.
Reagensi
Za određivanje gvožđa koriste se sledeći reagensi:
1) 10%-ni rastvor hidroksilamin-hlorhidrat: odmeri se 10 g NH2OH HCl, rastvori se u vodi i dopuni vodom do 100 ml. Čuva se u frižideru;
2) rastvor natrijum-acetata c(CH3COONa . 3H2O) = 4 mol/l:544 g CH3COONa . 3H2O rastvori se u vodi i dopuni vodom do 1000 ml;
3) puferni rastvor: 3,5 ml 4 mol (CH3COONa . 3H2O)/l dopuni se razblaženom sirćetnom kiselinom do 100 ml (115 ml glacijalne sirćetne kiseline razblaži se vodom do 1 litra), a zatim razblaži vodom do 1000 ml;
4) 1,10 - fenantrolin: odmeri se 0,2 g 1,1 - fenantrolin-monohidrata i rastvori u 100 ml hladne vode. Rastvor treba da je bezbojan i da se čuva u frižideru;
5) rastvor hlorovodonične kiseline c(HCl) = 2 mol/l;
6) koncentrovana hlorovodonična kiselina ((sigma) = 1,19 g/ml);
7) standardni rastvor gvožđa: rastvori se 0,8635 g NH4Fe (SO4) 12 H2O u vodi, doda 100 ml koncentrovane hlorovodonične kiseline ((ro) = 1,19 g/ml) i dopuni vodom do 1000 ml (1 ml odgovara 100 (mikro)g gvožđa). Od tog rastvora otpipetira se 50 ml u odmerni sud zapremine 250 ml i dopuni vodom do oznake (1 ml tako razblaženog rastvora odgovara 20 (mikro)g gvožđa i uvek se priprema neposredno pred upotrebu.
Određivanje
U odmerni sud zapremine 100 ml odmeri se alikvotni deo rastvora pripremljenog za analizu (metoda 33 ovog pravilnika), sa sadržajem gvožđa do 0,4 mg, doda rastvora 2 mol (HCl)/l tako da ukupna zapremina bude oko 30 ml, zatim se 1 ml hidroksilamin-hlorhidrata promućka i ostavi najmanje 2 min. Posle toga se pomoću 4 mol (CH3COONa . 3 H2O)/l, pH vrednost podesi na približno 3,5. Ako se rastvor zamuti zbog velike zastupljenosti kalcijuma u fosforu, doda se još nekoliko mililitara 2 mol (HCl)/l i pH vrednost ponovo podesi na 3,5. Zatim se doda 10 ml 1,10-fenantralina i puferom dopuni do oznake, promućka i ostavi 2 h.
Meri se ekstinkcija na 510 nm u kiveti dužine 1 cm u odnosu na slepu probu, koja sadrži samo reagens.
Za pripremanje standardne krive uzima se 0, 2,0; 5,0; 10,0; 15,0 i 20 ml razblaženog standardnog rastvora u odmerni sud zapremine 100 ml do 30 ml dopuni 2 mol (HCl)/l i postupa kao što je utvrđeno u postupku određivanja.
37. ODREĐIVANjE CINKA -SPEKTROFOTOMETRIJSKA METODA
Princip
U neutralnom ili slabo alkalnom rastvoru cink sa ditizonom (difenil-tiokarbazon) gradi crveno obojeni kompleks koji se ekstrahuje hloroformom ili ugljen-tetrahloridom. Ekstrakcija ugljen-tetrahloridom brža je nego ekstrakcija hloroformom. Metoda određivanja preko mešane boje u odnosu na jednu boju jednostavnija je i tačnija, pa se cink najpre izoluje, što se postiže razlaganjem cink-ditizonata u razblaženoj hlorovodoničnoj kiselini, uz dodavanje natrijum-dietilditiokarbamata.
Reagensi
Za pripremanje rastvora moraju se koristiti bidestilovana voda i bidestilovani amonijak.
Osim toga koriste se i sledeći reagensi:
1) standardni rastvor ZNSO4 dž 7H2O: odmeri se 0,4398 g ZNSO4 . 7H2O rastvori u 0,1 mol (HCl)/l i dopuni hlorovodoničnom kiselinom do 1000 ml (1 ml = 0,1 mg Zn). Od tog rastvora pipetom se odmeri 50 ml u odmernu tikvicu zapremine 500 ml i do oznake dopuni 0,1 mol (HCl)/(1 ml = 0,01 mg Zn);
2) 0,01%-ni rastvor difenil-ditiokarbazona u ugljen tetrahloridu (m/V)
3) 10%-ni (m/V) rastvor diamonijum-hidrokarbazona, toliko dugo tretiran rastvorom 0,01% (m/V) ditizona dok ugljen-tetrahloridni sloj ne postane zelen;
4) rastvor monohidrata limunske kiseline: rastvori se 210 g monohidrata limunske kiseline u približno 600 ml vode, doda se 350 ml 10 mol (NH3)/l i dopuni vodom do oznake (pH vrednost 9,4). Rastvor se čuva u polietilenskoj boci i postojan je sedam dana;
5) 0,25%-ni rastvor natrijum-dietil-ditiokarbamata, koji se priprema neposredno pred upotrebu (m/V);
6) mešani rastvor: u 100 ml pripremljenog rastvora monohidrata limunske kiseline doda se oko 300 ml vode, 50 ml pripremljenog rastvora 0,25% (m/V) natrijum-dietil-ditiokarbamata i dopuni vodom do 500 ml;
7) bidestilovan rastvor hlorovodonične kiseline, c(HCl) = 0,1 mol/l;
8) bidestilovan rastvor hlorovodonične kiseline, c(HCl) = 0,02 mol/l;
9) 0,02%-ni rastvor fenolftaleina u etalonu;
10) ugljen-tetrahlorid;
11) 0,01%-ni rastvor ditizona.
Određivanje
Alikvotni deo pripremljenog rastvora za analizu (metoda 33 ovog pravilnika) koji sadrži do 80 (mikro)g cinka uzima se u levak za odvajanje i dopuni vodom do 20 ml, zatim se doda 5 ml 10%-nog amonijum-citrata (ako se rastvor zamuti doda se još amonijum-citrata dok se zamućenje ne izgubi) i tri kapi fenolftaleina i koncentrovanog amonijaka sve dok boja ne počne da se menja. Posle dodavanja dve kapi amonijaka u višku i oko 5 ml rastvora 0,01%-nog ditizona, rastvor se dva minuta snažno mućka (najbolje na mućkalici) i ekstrakt ditizona prenese u drugi levak za odvajanje. Mućkanje ditizonom ponovi se na isti način toliko puta dok boja ne postane zelena.
Preporučuje se da se posle svakog izdvajanja ekstrakta ditizona zidovi levka za odvajanje isperu sa 2 ml čistog ugljen-tetrahlorida kako bi se pokupile kapi koje se nalaze na površini (ne treba mućkati).
Sjedinjeni ekstrakti ditizona snažno se mućkaju 2 min sa 50 ml 0,02 ml (HCl)/l, pri čemu cink prelazi u vodenu fazu. Rastvor ditizona se baci, a rastvor hlorovodonične kiseline se još jedanput kratko izmućka sa 5 do 10 ml čistog ugljen-tetrahlorida. U kiseli rastvor hlorovodonične kiseline doda se 50 ml mešanog rastvora i 10 ml 0,01% rastvora ditizona. Smeša se, 1 min snažno mućka i ekstrakt ditizona se filtrira kroz filtrir-papir (bela traka 7 cm) u odmerni sud zapremine 50 ml. Tada se gornja površina vodenog rastvora ispere sa 2 ml čistog ugljen-tetrahlorida i bez mućkanja ispusti u odmerni sud. Posle ispiranja filtrir-papira doda se ugljen-tetrahlorid do oznake. Rastvor se promućka i boja meri na 535 nm u odnosu na slepu probu, u kiveti dužine 0,5cm.
Za pripremanje standardne krive uzima se 1 ml standardnog rastvora koji odgovara 0,01 mg Zn. Uzima se 0, 1,0; 2,0; 4,0; 6,0 i 8,0 ml, dopuni se vodom do 20 ml i dalje postupa kao što je utvrđeno u postupku određivanja.
38. ODREĐIVANjE BAKRA - SPEKTROFOTOMETRIJSKA METODA
Princip
Kao reagens za određivanje koristi se olovna so dietil-ditiokarbamat, na koju nemaju uticaja joni Fe(III), Mn(II), Ni(II) i Co(II).
Smetnje pričinjavaju srebro, živa i talijum, ali kad su zastupljeni dvadeset puta više od bakra. Već 3 (mikro)g bizmuta smeteju određivanju 10 (mikro)g bakra, pa se prisutan bizmut tada odstranjuje mućkanjem organskog ekstrakta sa rastvorom 5 mol (HCl)/l ili rastvorom 2 mol (NaOH)/l. Bakar-dietil-ditiokarbamat kompleks može se ekstrahovati toluolom, hloroformom ili ugljen-tetrahloridom.
Reagensi
Za određivanje bakra koriste se sledeći reagensi:
1) standardni rastvor bakra: odmeri se 0,3928 g CuSO4 . 5H2O rastvori u 1 mol (HCl)/l i dopuni hlorovodoničnom kiselinom do 1000 ml (1 mol = 0,1 mg Cu). Od tog rastvora uzima se 20 ml i vodom razblaži do 1 litra (1 ml = 2 ng Cu);
2) 0,01%-ni rastvor olovo-dietilditiokarbamata u toluolu. Rastvor se čuva u mraku ili u tamnoj boci;
3) 50%- ni rastvor diamonijum-hidrogencitrata (m/V);
4) rastvor natrijum-hidroksida c(NaOH) = mol/l;
5) bidestilisan amonijak;
6) toluol;
7) 1%-ni rastvor fenolftaleina u etanolu (m/V).
Određivanje
Odmeri se 1 do 10 ml rastvora pripremljenog za analizu (metoda 33 ovog pravilnika) koji sadrži do 40 (mikro)g bakra i prenese u levak za odvajanje, zapremina 100 ml, dopuni sa 20 ml vode, doda 5 ml 50%-nog diamonijum-citrata i do 2 kapi fenolftaleina i amonijaka, sve dok boja ne počne da se menja. Zatim se doda 20 ml olovo-dietil-ditiokarbamata, mućka 5 min, ostavi se da se faze razdvoje i ispusti se vodeni sloj. Čep i zidovi levka operu se vodom. Organska faza se tretira sa 25 ml rastvora 2 mol (NaOH)/l i mućkanje ponovi 5 min. Posle odvajanja faza ispusti se vodeni sloj, a ekstrakt toluola se preko filtrir-papira (bela traka) ispusti u odmerni sud zapremine 25 ml i toluolom dopuni do oznake. Zatim se u kiveti dužine 2 cm meri apsorbancija žuto obojenog kompleksa na 435 nm u odnosu na slepu probu.
Standardna kriva priprema se od razblaženog standardnog rastvora koji u 1 ml sadrži 2 (mikro)g bakra. U levak za odvajanje uzima se 2,5; 5,0; 10,0; 15,0 i 20 ml razblaženog standardnog rastvora i dalje postupa kao što je utvrđeno u postupku određivanja.
39. ODREĐIVANjE KAROTINA (BRZI POSTUPAK)
Princip i primena
Princip se zasniva na ekstrakciji pigmenta u petroletru i odvajanju pigmenata primenom kolonske hromatografije i određivanju intenziteta boje spektrofotometrijskim merenjem.
Metoda se primenjuje za brzo određivanje karotina u svežim i suvim uzorcima stočne hrane.
Reagensi
Potrebni su sledeći reagensi, čistoće pro analysi, a voda mora biti destilovana:
1) petroletar, tačke ključanja između 30oC i 70oC;
2) petroletar, tačke ključanja između 80oC i 120oC;
3) ekstrakovana smesa, koja se sastoji iz jedne zapremine petroletra, tačke ključanja između 40oC i 70oC i dve zapremine petroletra, tačke ključanja između 80oC i 120oC;
4) aceton;
5) natrijum-sulfat, bezvodni;
6) apsorbens: komercijalno koštano brašno ekstrahovano 8 h acetonom i 8 h petroletrom, zatim sušeno i prosejano kroz sito sa otvorima čiji je prečnik 0,36 mm.
Aparatura i pribor
Osim uobičajene laboratorijske opreme, potreban je sledeći pribor:
1) vodeno kupatilo, sa regulacijom temperature na 90oC;
2) hromatografska cev, unutrašnjeg prečnika 12,5 mm i dužine 30 cm, sa kapilarnom cevi čiji je donji deo zaronjen u grlo odmerne tikvice zapremine 100 ml;
3) vakuumska naprava za filtraciju za hvatanje eluata u odmernu tikvicu (videti sl. 4 u prilogu);
4) analitička vaga.
Pripremanje svežeg biljnog uzorka iz silaže
Odmeri se 100 g dobro promešanog uzorka i isecka nožem ili odgovarajućom sečkom.
Pripremanje uzorka iz suve biljne mase
Samelje se 20 g suve biljne mase, tako da usitnjene čestice mogu proći kroz sito veličine otvora 1 mm.
Određivanje
Ekstrakcija pigmenata
Ekstrakcija pigmenata iz sveže biljne mase i silaže
Odmeri se 2 g pripremljenog uzorka sa tačnošću 0,001 g, stavi se u tarionik, doda se 5 g peska i 5 g bezvodnog natrijum-sulfata i meša se dok se ne dobije suv homogeni prašak.
Samlevena masa se kroz cev ubaci u mernu posudu zapremine 100 ml. Tarionik se ispere postepenim dolivanjem u bocu 20 ml ekstrakcione smeše. Povratni kondenzator se namesti na bocu, koja se uroni u vodeno kupatilo zagrejano na 90oC i ostavi 1 h.
Ekstrakcija pigmenata iz suve biljne mase
U mernu bocu zapremina 100 ml odmeri se 1 g uzorka, sa tačnošću 0,01 g i doda se 40 ml ekstrakcione smeše. Povratni kondenzator se namesti na bocu, koja se uroni u vodeno kupatilo zagrejano na 90oC i ostavi 1 h.
Odvajanje pigmenata
Hromatografska kolona u hromatografskoj cevi napuni se apsorbensom. Pre punjenja kolone, na donji deo cevi stavi se malo staklene vune ili pamuka. Visina sloja apsorbensa mora iznositi oko 10cm. Slaganje apsorbansa reguliše se pomoću vakuumske sisaljke, gornja površina apsorbensa se poravna tupim štapićem i na nju stavi sloj bezvodnog natrijum-sulfata visine 1 cm i čvrsto pritisne. Hromatografska kolona se navlaži petroletrom, čija je tačka ključanja između 40oC i 70oC. Za regulisanje protoka ekstrakta u koloni koristi se vakum i eluat hvata u odmernu tikvicu zapremine 100 ml. Za eluiranje karotina upotrebljava se 50 ml petroletra, tačke ključanja između 40oC i 70oC, u nekoliko navrata, tako da površina kolone nikad ne bude bez tečnosti. Dovoljno je 50 ml da karotinski obruč kvantitativno pređe u eluat. Ta hromatografska kolona se upotrebljava sve dok se ne dobije zona ostalih pigmenata do 2 cm iznad donjeg dela cevi. Eluat se do oznake dopuni petroletrom, tačke ključanja između 40oC i 70oC i spektrofotometrom se odredi sadržaj karotina.
Određivanje apsorbencije
Apsorbencija rastvora određuje se pomoću spektrofotometra, na talasnoj dužini od 450 nm i pripremi se standardna prava iz standardnih rastvora karotina visoke čistoće. Za veću tačnost treba napraviti takve koncentracije rastvora da njihova apsorbancija bude između 0,25 i 0,75.
Izračunavanje
Sadržaj karotina izražava se u mg/kg i izračunava se po sledećoj formuli:
(m . V) / (m1 . l)
gde je:
m - karotin očitan sa krive, u (mikro)g;
V - zapremina eluata, u mililitrima;
m1 - odvaga uzorka u eluatu, u (mikro)g;
l - debljina kivete, u centimetrima.
Ako ne postoji standardna kriva, karotin se izračunava po sledećoj formuli:
(E . V . 100) / (260 . l . m1)
gde je:
E - apsorbancija eluata;
V - zapremina eluata, u mililitrima;
m1 - masa uzorka u eluatu, u (mikro)g;
l - debljina kivete, u centimetrima.
Ponovljivost
Razlika između rezultata dva određivanja na istom uzorku koja jedno za drugim izvodi isti analitičar ne sme biti veća od 8% srednje vrednosti dobijenog rezultata.
40. ODREĐIVANjE KAROTINA I KSANTOFILA U SVEŽIM I SUVIM UZORCIMA BILjNOG POREKLA
Princip i primena
Metoda se primenjuje za određivanje karotina i ksantofila u uzorcima svežeg i suvog biljnog materijala, koji sadrži više od 30 mg karotina po 1 kg stočne hrane .
Princip se zasniva na ekstrakciji suve biljne mase pomoću heksana i acetona, a sveže hrane - na ekstrakciji acetonom. Posle ekstrakcije vrši se osapunjenje pomoću alkoholnog rastvora kalijum-hidroksida, ekstrakt pigmenta se uparava, ostatak se rastvara u petroletru i karotin hromatografski odvoji eluiranjem petroletrom, a ksantofil - eluiranjem etanolom. Količina izdvojenih pigmenata određuje se spektrofotometrijskim merenjem.
Reagensi
Koriste se sledeći reagensi, čistoće pro analysi i destilovana voda:
1) n-heksan, čist;
2) aceton, čist;
3) n-heksan-acetonska smeša (7:3), 70 delova čistog p-heksana i 30 delova čistog acetona;
4) petroletar (tačka ključanja 30 do 50oC);
5) 40%-ni etanolni rastvor KOH; pre upotrebe rastvori se 4 g kalijum-hidroksida u nekoliko kapi vode i do 10 ml dopuni etanolom;
6) natrijum-sulfat, bezvodni;
7) natrijum-sulfat, zasićen vodeni rastvor;
8) aluminijum-oksid za hromatografiju, standardizovano po Brokmanu (Brockman), žari se 8 h na temperaturi 750oC, ohladi u eksikatoru i čuva u boci od tamnog stakla sa brušenim zatvaračem. Pre upotrebe za hromatografiju doda se 91 g aluminijum-oksida i 9 ml destilovane vode, snažno promućka i 9 h čuva u tamnoj boci sa brušenim zatvaračem;
9) etanol 96%-ni;
10) azot, gas.
Aparatura i pribor
Osim uobičajene laboratorijske opreme, koristi se i sledeći pribor:
1) kolone za hromatografiju, dužine od 15 do 30 cm, prečnika od 10 do 15 mm;
2) vakum-uparivač;
3) spektrofotometar.
Pripremanje uzorka iz svežeg biljnog materijala
Odmeri se 10 g iseckanog biljnog materijala, sa tačnošću od 0,001 g, stavi se u homogenizator, doda 50 ml acetona i meša tako da se pigmenti ekstrahuju. To se ponovi najmanje tri puta. Sjedinjeni ekstrakti se filtriraju preko staklenog filtrir-lončića u mernu tikvicu zapremine 200 ml i tikvica se dopuni acetonom do oznake.
Pripremanje uzorka iz suvog biljnog materijala
U odmerni sud odgovarajuće zapremine ili u odgovaraju bocu sa brušenim zatvaračem odmeri se od 2 do 10 g, sa tačnošću od 0,001 g, fino usitnjenog uzorka prosejanog kroz sito veličine otvora 0,5 mm, doda od 30 do 50 ml smeše heksana i acetona, uvede azot ili drugi inertni gas, promućka i ostavi na tamnom mestu da prenoći.
Određivanje
Osapunjenje ekstrakta svežeg biljnog materijala
U levak za odvajanje otpipetira se od 20 do 50 ml ekstrakta, zavisno od očekivane količine pigmenta, doda se 0,5 ml 40%-nog rastvora etanol-hidroksida i snažno promućka i ostavi da miruje pola sata. Zatim se doda od 30 do 50 ml petroletra i snažno promućka da bi pigmenti kvantitativno prešli u fazu petroletra. Donji sloj se ispusti, ostaci rastvora etanolnog kalijum-hidroksida i acetona se odstrane ispiranjem ekstraktom petroletra, dva puta sa po 100 ml vode. Na kraju se ostaci vode odstrane mućkanjem ekstrakta sa po 10 ml zasićenog vodenog rastvora natrijum-sulfata.
Prečišćeni ekstrakt petroletra blagim zagrevanjem u vakumu uparava se do suvog ostatka i odmah rastvori sa 5 ml heksana.
Ako uzorak ne sadrži masti i hlorofil, saponifikacija se može izostaviti.
Osdapunjenje ekstrakta suvog biljnog materijala
Jedan sat pre hromatografskog odvajanja pigmenata, u ekstrakt se doda 2 ml 40%-nog etanolnog rastvora kalijum-hidroksida, snažno promućka i ostavi pola sata na tamnom mestu. Zatim se doda 2 ml destilovane vode, još jedanput promućka i ostavi da se slegnu čvrste čestice. Zatim se zapremina reguliše dodavanjem čistog n-heksana do oznake. Alikvotni deo, obično 50 ml, otpipetira se u bocu za vakumsko uparavanje. Uparavanje se vrši do suva, blagim zagrevanje do temperature 40oC i ostatak odmah rastvori sa 5 ml n-heksana.
Hromatografsko određivanje
Hromatografska cev se napuni aktiviranim aluminijum-oksidom. Pre punjenja kolone, na donji deo se stavi malo staklene vune ili pamuka. Visina sloja apsorbensa mora iznositi 10cm. Na gornji sloj apsorbensa doda se sloj bezvodnog natrijum-sulfata, visine 2 cm, dobro ovlaži petroletrom i počinje hromatografija. Protok se reguliše vakuumom ili natpritiskom, tako da protok bude 1 do 2 kapi u sekundi. Karotin se eluira pomoću petroletra i eluat hvata u mernu bocu zapremine 50 ili 100 ml. Eluiranje je završeno kad se primeti da kapi više ne sadrže obojene materije. Eluat se u odmernoj boci dopuni petroletrom.
Ksantofil se eluira iz kolone pomoću 96%-nog etanola, hvata se u mernu bocu zapremine 100 ili 200 ml, sve dok se ne dobiju bezbojne kapi. Zapremina se reguliše dodavanjem etanola do oznake.
Apsorbancija dobijenih eluata meri se na talasnoj dužini od 450 nm, uz obaveznu primenu standardne prave, i to: karotin prema petroletru, a ksantofil prema etanolu.
Izračunavanje
Količina karotina i ksantofila izražava se u mg/kg i izračunava se po sledećoj formuli:
(očitavanje . B) / (m . l)
gde je:
očitavanje - karotina, odnosno ksantofila sa standardne krive, u (mikro>g;
V - zapremina eluata, u mililitrima;
m - masa uzorka u eluatu (V), u mililitrima;
l - debljina optičkog sloja kivete, u centimetrima.
Ponovljivost
Razlika između rezultata dva uporedna određivanja koja je, istovremeno ili neposredno jedno za drugim, sa istim reagensima izveo isti analitičar, ne sme biti veća od 9% do srednje vrednosti dobijenih rezultata.
41. ODREĐIVANjE VITAMINA A
Princip
Podesna količina uzorka osapunjuje sa alkoholnim rastvorom KOH. Neosapunjivi deo, koji sadrži vitamini A, ekstrahuje se petroletrom, dobijeni ekstrakt čisti se preko kolone različitim apsorbensima, a u prečišćenom ekstraktu odredi se vitamin A Carr-Priceovim reagensom.
Reagensi
Za određivanje vitamina A koriste se sledeći reagensi:
1) etanol 99%, r.a.;
2) kalijum-hidroksid, KOH, r.a.;
3) petroletar, tačke ključanja od 40 - 70oC, r.a.;
4) aceton, r.a.;
5) natrijum-sulfat, Na2S2O3, bezvodni, p.a.;
6) magnezijum-oksid, MgO, r.a.;
7) kiselgur G, za tankoslojnu hromatografiju;
8) aluminijum-oksid, Al2O3 - standard za hromatografsku adsorpcijsku analizu po Brokmanu, st. aktivnosti II-III;
9) hloroform, r.a.;
10) antimon-trihlorid, SvCl3 kristalni;
11) anhidrid sirćetne kiseline, r.a.;
12) vitamin A standard: kao standard se obično upotrebljava kristalizovan vitamin A acetat i vitamin A palmitat, rastvoren u ulju poznate jačine. Standard vitamina A palmitat rastvori se u prečišćenom hloroformu i razredi na koncentraciju od 30 I.J./1 ml - radni rastvor standarda. Standard vitamin A acetat podvrgne se saponifikaciji i ekstrakciji (merenju), tako da koncentracija koja se meri u hlorofomnom rastvoru bude 30 I.J./1 ml radnog rastvora standarda. Rastvor standarda priprema se neposredno pred upotrebu.
Aparatura i pribor
Za određivanje vitamina A koristi se sledeća aparatura i pribor:
1) aparatura za destilaciju u vakumu NB 29, s tikvicama za otparavanje, zapremine 100, 250 i 500 ml;
2) tikvice za jodni broj, zapremine 100, 250 i 500 ml;
3) uređaj za hromatografiju: hromatografska kolona, dužine 20 cm, prečnika 2,50 cm (NV 14), tikvice sa okruglim dnom zapremine 100 ml NV 14, nastavak za hromatografiju na koloni NV 14;
4) vakum-sisaljka;
5) kolorimetar ili spektrofotometar.
Pripremanje Carr-Priceovog reagensa
Masa od 120 g SbCl3, promeša se u tikvici za jodni broj sa približno 200 ml hloroforma, prethodno izmućkanog s vodom i predestilovanog uz korišćenje Vigreuhove kolone. Posle stajanja u tami, sadržina tikvice se zagreje do vrenja, dok se ne otopi sav SbCl3 i posle hlađenja prenese u suvu odmernu tikvicu zapremine 500 ml i dopuni do oznake. Reagens je upotrebljiv posle dva do tri dana.
Pripremanje kolone sa magnezijum-oksidom + kiselgurom
Magnezijum-oksid i kiselgur suše se 2 h pri temperaturi od 105oC, ohlade u eksikatoru i promešaju u odnosu 1 + 1 (m/m). Masa od 5 g te mešavine stave se na kolonu, na čijem dnu se nalazi komadić vate. Kolona se puni pomoću vakuma. Na tako pripremljenu kolonu uzorak se nanosi direktno, bez prethodnog ispiranja rastvaračem.
Pripremanje kolone sa aluminijum-trioksidom
Aluminijum-oksid se 3 h žari pri temperaturi 550oC i zatim upotrebljava kao adsorbens. Masa od 10 g tako pripremljenog Al2O3 promeša se sa 0,15 ml vode i stavlja na kolonu, na čijem se dnu nalazi komadić vate. Sloj bezvodnog natrijum-sulfata debljine 0,2 cm, stavi se na vrh kolone. Pre nanošenja uzorka, kolona se ispira petroletrom.
Određivanje
Homogenizovani uzorak u količini od 10 do 25 g, izmeren na analitičkoj vagi (količina zavisi od vrste stočne hrane, odnosno od koncentracije vitamina A u hrani), saponifikuje se uz dodavanje 150 ml etanola i 37,50 ml 50%-nog rastvora KOH u etanolu. Saponifikacija se vrši uz povratno hlađenje 30 min. U levak za odeljivanje prebaci se 75 ml tekućeg sloja, doda se 60 ml vode i ekstrakcija vitamina A vrši sa 5 . 50 ml petroletra. Sakupljeni petroletarni ekstrakti peru se sa 3 . 50 ml vode i suše s natrijum-sulfatom, a zatim ispare do volumena od približno 20 ml. Ostatak se prebaci u suvu odmernu tikvicu zapremine 100 ml i sadržaj dopuni petroletrom do oznake. Količina od 50 ml petroletarskog ekstrakta, koja sadrži vitamin A i karotine, prebaci se na kolonu sa MgO + kiselgur, a eluiranje se vrši sa smesom rastvora acetona i petroletra u odnosu 2 + 98 (V/V)-(eluiranje karotina). Vitamin A se eluira sa smesom rastvora etanola i petroletra u odnosu 8 + 92(V/V) dok sav vitamin ne bude eluiran. Sakupljeni eluati ispare do suvog ostatka u vakumu na vodenom kupatilu pri temperaturi 60oC, a suvi ostatak se rastvori u 2 ml hloroforma.
Merenje
Koncentracija vitamina A meri se na kolorimetru, uz crveni filtar, ili na spektrofotometru, na talasnoj dužini 620 nm. Uporedo se meri apsorbancija uzorka i standardnog rastvora, uz slepu probu.
Slepa proba: 1 ml hloroforma, 6 kapi anhidrida sirćetne kiseline i 4 ml Carr-Priceovog reagensa.
Standard vitamina A: 0,20 ml hloroformnog rastvora standarda (6 I.J.) vitamina A, 0,80 ml hloroforma, 6 kapi anhidrida sirćetne kiseline i 4 ml Carr-Priceovog reagensa.
Uzorak: 0,2 ml hloroformnog rastvora uzorka, 0,80 ml hloroforma, 6 kapi anhidrida sirćetne kiseline i 4 ml Carr-Priceovog reagensa.
Zbog nestabilnosti plave boje, potrebno je odmah posle dodavanja Carr-Priceovog reagensa (najviše 10 sekundi) očitani apsorbanciju plave boje.
Izračunavanje
Koncentracija uzorka izražava se u mg/kg i izračunava po sledećoj formuli:
Ku = (Eu . Ks . F . 1000) / (Es . m)
: 91;0:gde je:
: 91;0:Eu = ekstrakcija uzorka;
Ks = koncentracija standarda (u I.J.)
Es = ekstrakcija standarda;
F = faktor razređenja;
m = odvaga uzorka, u gramima.
42. ODREĐIVANjE VITAMINA E
A) Uzorak koji sadrži više od 50 mg/kg vitamina E
Princip
Uzorak koji se ispituje, saponifikuje sa rastvorom KOH u etanolu, uz dodatak hidroksida. Posle hlađenja reakcijske smese, ekstrahuje se alfa-tokoferol dietil-etrom, ekstrakt etra se ispira bazom, a zatim vodom i dopuni do određene zapremine. Alikvotni deo ekstrakta etra ispari u vakumu do suvog ostatka, koji se otopi u benzenu i prebaci na prethodno pripremljenu kolonu hromatografa. Eluat ispari u vakumu, a suvi ostatak se otopi u etanolu, čija je zapremina tačno određena. Alikvotni deo alkoholnog rastvora oksiduje se s rastvorom ferihlorida, doda se rastvor dipiridina i razvijena boja posle 2 min očita na fotometru na 520 mm, uz slepu probu. Na isti način i pod istim uslovima rada istovremeno se izmeri apsorbancija standarda poznate koncentracije. Iz podataka dobijenih merenjem i faktora razređenja izračuna se koncentracija vitamina E u uzorku.
Reagensi
Za određivanje vitamina E koriste se sledeći reagensi:
1) etanol 99%-ni, r.a.;
2) hidrokinon, r.a.;
3) dietiletar, r.a.;
4) kalijum-hidroksid, KOH;
5) natrijum-sulfat, Na2S2O3, bezvodni, r.a.;
6) benzen, r.a.;
7) ferihlorid, FeCl3 : 50 mg FeCl3 . 6H2O rastvori se u 25 ml etanola (rastvor se priprema svež, svakodnevno);
8) (alfa) (alfa)' - dipiridin: 50 mg otopi se u 10 ml etanola (rastvor se priprema svež, svakodnevno);
9) aktivna zemlja: 2 g Bleicherde prokuva se dva minuta s rastvorom, koji se priprema rastvaranjem 0,40 g SnCl2 dž 2H2O u 10 ml koncentrovane HCl;
10) hlorovodonična kiselina, koncentrovana;
11) kiselgel G: 2 g kiselgela G, sušenog 30 min pri temperaturi 110oC i pomeša se s malo suvog benzena;
12) d,l-(alfa) - tokoferol standard: C29H50O2 čuva se na tamnom mestu, na sobnoj temperaturi, uz obavezno uvođenje inertnog gasa posle svake upotrebe.
Aparatura i pribor
Za određivanje vitamina E koristi se sledeća aparatura i pribor:
1) aparatura za destilaciju u vakuumu (NB), s tikvicama za isparavanje, zapremine 100, 250 i 500 ml;
2) tikvice za jodni broj, zapremine 300 ml;
3) levci za odeljivanje, zapremine 500 ml;
4) odmerne tikvice, čaše, obični levci;
5) uređaj za hromatografiju: hromatografska kolona dužine 20 cm, prečnika 2,50 cm (NB 14), tikvice okruglog dna, zapremine 100 ml (NB 14); nastavak za hromatografiju na koloni NB 14;
6) kolorimetar ili spektrofotometar;
7) vakuum-sisaljka.
Pripremanje kolone
Dva grama aktivne zemlje stavi se u hromatografsku kolonu, tečnost se ispusti, a adsorbens se tri puta ispere sa po 3 ml etanola. Ispiranje se nastavlja s benzenom (5 . 5 ml). Na kolonu se zatim stavi 2 g kiselgela, razmućenog u benzenu. Suvišak benzena ispusti se iz kolone, tako da nivo tečnosti bude 2 do 3 ml iznad granice slegnutog adsorbensa.
Pripremanje standarda vitamina E
U čistu i suvu odmernu tikvicu zapremine 25 ml odmeri se određena količina standarda vitamina E i, dodatnim razređivanjima etanolom, koncentracija podesi na vrednost od približno 20 (mikro)g/2 ml. Standard vitamina E priprema se za svako određivanje vitamina E.
Postupak
Na analitičkoj vagi odmeri se 1 g homogenizovanog uzorka u tikvicu za saponifikaciju zapremine 250 ml, doda se 30 ml etanola i 3 ml rastvora KOH 1 + 2(V/V) i oko 50 mg hidrokinona. Saponifikacija se vrši na vodenom kupatilu, uz povratno hlađenje 30 min. Ovaj postupak, kao i svi kasniji postupci, izvodi se na mestu zaštićenom od svetlosti. Posle saponifikacije sadržaj tikvice se kvantitativno prebaci u levak za odvajanje, sa ukupno 50 ml destilovane vode. Tikvica se nekoliko puta ispere sa 50 ml etra, koji se takođe doda u levak za odeljivanje. Sadržaj u levku ekstrahuje se sa 5 dž 50 ml etra. Sakupljeni ekstrakt etra ispira se vodom, a rastvor KOH u 3%-nom etanolu i ponovo vodom, sve dok ekstrakt prestane da pokazuje baznu reakciju. Ostatak ekstrakta etra osuši se bezvodnim natrijum-sulfatom i prebaci u tikvicu za isparavanje uz dodavanje etra, kojim se ispira levak za odvajanje. Ekstrakt etra ispari u vakumu do suvog ostatka na vodenom kupatilu pri temperaturi 60oC. U suvi ostatak doda se 5 ml benzena. Rastvor benzena prebaci se kvantitativno na kolonu i vitamin E eluira s ukupno 7 . 5 ml benzena. Sakupljeni eluati ispare u vakumu do suvog ostatka pri temperaturi 60oC, a suvi ostatak se rastvori u 10 ml apsolutnog alkohola. Merenje se vrši posle 2 min, kako uzorka tako i standard vitamina E, i to na fotoelektričnom kolorimetru uz zeleni filter, odnosno na spektrofotometru na 520 nm.
Merenje
Slepa proba: 3 ml alkohola + 1 ml ferihlorida + 1 ml (alfa) (alfa)' - dipiridina.
Standard vitamina E: 2 ml alkoholnog rastvora, koji sadrži oko 20 g vitamina E + 1 ml etanola + 1 ml ferihlorida + 1 ml (alfa) (alfa)' - dipiridina.
Uzorak: alikvotni deo od 2 ml alkoholnog rastvora vitamina E + 1 ml etanola + 1 ml etanola + 1 ml (alfa) (alfa)' - dipiridina + 1 ml ferihlorida.
Izračunavanje
Koncentracija uzorka izražava se u mg/kg vitamina E acetata i izračunava se po sledećoj formuli:
Ku = (Eu . Ks . F . 1000) / (Es . m . 0,911)
gde je:
Eu - apsorbancija uzorka;
Ks - koncentracija standarda, u miligramima;
Es - apsorbancija standarda;
F - faktor razređenja;
m - odmerni uzorak, u gramima;
0,911 - faktor za preračunavanje D, L alfa-tokoferola u vitamin E acetat.
B) Uzorak koji sadrži manje od 50 mg/kg vitamina E
Princip
Uzorak za ispitivanje saponifikuje se s rastvorom KOH u apsolutnom alkoholu (etanolu), uz dodavanje hidrokinona. Posle hlađenja reakcijske smese se ekstrahuju (alfa-tokoferol s dietil-etrom), ekstrakt etra ispira bazom, a zatim vodom i dopuni do određene zapremine. Alikvotni deo ekstrakta etra ispari u vakumu do suvog ostatka koji se rastvori u apsolutnom alkoholu (etanolu). Alikvotni deo uzorka nanosi se na ploču za tankoslojnu hromatografiju (TLC) i ploča se stavi na razvijanje. Uz uzorak, na ploču se nanosi i standard tokoferola. Posle razvijanja, ploča se prska reagensom (ferihlorid + (alfa) - adipiridil). Mrlje rastvora uzorka i standarda moraju se međusobno podudarati po izgledu i po RF vrednostima.
Reagensi
Za određivanje vitamina E koriste se sledeći reagensi:
1) etanol 99%, r.a;
2) dietil-etar r.a;
3) kalijum hidroksid, KOH;
4) natrijum sulfat, Na2S2O3, bezvodni;
5) hidrokinon, r.a;
6) benzen, r.a;
7) ferihlorid, FeCl3 : 50 FeCl3 dž 6H2O rastvori se u 25 ml etanola (rastvor se priprema neposredno pred upotrebu);
8) (alfa) (alfa)' - dipiridin: 50 mg otopi se u 10 ml etanola (rastvor se priprema neposredno pred upotrebu);
9) silikagel G za hromatografiju;
10) metanol, r.a.;
11) d.l - (alfa) - tokoferol standard C29H50O2 čuva se na sobnoj temperaturi, na tamnom mestu, uz obavezno uvođenje inertnog gasa posle svake upotrebe.
Aparatura i pribor
Za određivanje vitamina E koriste se sledeća aparatura i pribor:
1) aparatura za destilaciju u vakumu (NB), s tikvicama za isparavanje, zapremina 250 ml;
2) tikvice za jodni broj;
3) levci za odeljivanje, zapremine 500 ml;
4) odmerne tikvice, čaše, obični levci;
5) uređaj za TLC;
6) staklene ploče, dimenzija 20 dž 20 cm;
7) stakleni cilindri za razvijanje ploča za TLC, dimenzija 60 dž 60 dž 40 cm;
8) UV uređaj - fluorescentni ispitivač s kratkotalasnim i dugotalasnim svetlom (254 i 365 nm);
9) plastični most za podelu hromatografske podloge na polja i za nanošenje ekstrakta uzorka i rastvora standarda;
10) mikropipete, zapremine 10 (mikro)l.
Pripremanje ploča za TLC
Masa od 6 g silikagela G meri se u koničnoj tikvici sa staklenim čepom, zapremine 100 ml, i doda 20 ml mešavine rastvora 96%-nog etanola i vode, u odnosu 135 + 15 (V/V). Ploča se očisti vatom natopljenom etanolom i sadržaj tikvice izlije se na tako očišćenu ploču. Tečan adsorbens iznivelira se tako da sloj bude jednoličan. Ploča se osuši na vazduhu, a zatim aktivira pri temperaturi 105oC u trajanju 1 do 2 h.
Pripremanje standarda vitamina E
U čistu i suvu odmernu tikvicu zapremine 25 ml odmeri se određena količina standarda vitamina E (alfa-tokoferol) i dodatnim razređenjima apsolutnim alkoholom koncentracija se podesi na vrednost 500 (mikro)g/1 ml. Standard se priprema uz svako određivanje vitamina E.
Postupak
Na analitičkoj vagi odmeri se 10 g uzorka i prenese u tikvicu za saponifikaciju, zapremine 250 ml, doda 30 ml 99%-nog etanola i oko 50 mg hidrokinona. Saponifikacija se vrši na vodenom kupatilu, uz povratno hlađenje 30 min. Ovaj postupak, kao i svi kasniji postupci, izvodi se na mestu zaštićenom od svetlosti. Posle saponifikacije, sadržaj tikvice se kvantitativno prebaci u levak za određivanje, sa ukupno 50 ml destilovane vode. Tikvica se nekoliko puta ispere sa ukupno 50 ml etra, koji se takođe doda u levak za odeljivanje. Sadržaj u levku se ekstrahuje sa 5 . 50 ml etra. Sakupljeni ekstrakti etra ispiraju se vodom, rastvorom KOH u 3%-nom etanolu i ponovo vodom, dok ekstrakt prestane da pokazuje baznu reakciju. Ekstrakt etra osuši se bezvodnim natrijum-sulfatom i prebaci u tikvicu za isparavanje uz dodavanje etra, kojim se ispira levak za odeljivanje. Ekstrakt etra ispari u vakuumu do suvog ostatka na vodenom kupatilu, pri temperaturi 60oC. U suvi ostatak doda se toliko mililitara 99%-nog etanola da u 30 ml bude 15 (mikro)g vitamina E (zavisno od količine vitamina E u uzorku). Na pripremljenu ploču za TLC nanosi se, u obliku crte (dužine 1,50 cm), 30 (mikro)l ekstrakta uzorka, 30 (mikro)l S/2 (polovina koncentracije standarda, koja se dobija razređivanjem standarda s 99%-nim etanolom, u odnosu 1 + 1). Tako pripremljena ploča stavlja se u cilindar za razvijanje, u kome se nalazi oko 200 ml razvijača (benzol i metanol u odnosu 1 : 99). Hromatogram se razvija dok front rastvarača dostigne visinu od približno 15cm. Posle razvijanja ploča se suši na vazduhu i prska reagensom: najpre rastvorom, FeCl, a zatim (alfa) (alfa)' - dipiridolom. Mrlje rastvora uzorka i standarda moraju se međusobno podudarati po izgledu i po RF-vrednostima. Koncentracija vitamina E očitava se upoređivanjem intenziteta obojenja ekstrakta uzorka s intenzitetom obojenja standardnog rastvora. Ako su intenziteti obojenja uzorka i standarda različiti, ponovi se TLC uz dodatna razređivanja ili standardnog rastvora ili rastvora uzorka. Kad intenzitet obojenja standardnog rastvora i uzorka postane identičan, izračuna se približna koncentracija uzorka, uz poznatu koncentraciju standarda i faktor razređenja.
43. ODREĐIVANjE MIKOTOKSINA
Princip
Mikotoksin se određuje tankoslojnom hromatografijom. Ohratoksin, kao relativno jaka kiselina, ekstrahuje se iz rastvor zasićenim natrijum-hidrokarbonatom; slabo kiseli zearalenon ekstrahuje se jakom bazom, tako da neutralni alfatoksin ostaje u rastvoru.
Reagensi
Za određivanje mikotoksina koriste se sledeći reagensi:
1) acetonitril - voda (90 + 10);
2) heksan;
3) hloroform, CHCl3;
4) zasićeni rastvor NaHCO3 (pH = 7,8);
5) rastvor natrijum-hidroksida, c = 1 mol (NaOH)/l;
6) rastvor fosforne kiseline, c = 5 mol (1/3 H3PO4)/l;
7) rastvor hlorovodonične kiseline, c = 1 mol (HCl)/l;
8) rastvor benzol-acetonitril (98 + 2);
9) bezvodni natrijum-sulfat, Na2SO4;
10) silikagel H, tip 60 za tankoslojnu hromatografiju;
11) rastvor toluola, etilacetata i mravlje kiseline (50 + 40 + 10);
12) rastvor sumporne kiseline i metanola (20 + 80);
13) standardni rastvori;
- alfatoksin B1 - 0,5 (mikro)g/ml;
- ohratoksin A - 5 (mikro)g/ml;
- zearalenon - 50 (mikro)g/ml;
- benzol-acetonitril (98 + 2).
Aparati
Koristi se aparatura za tankoslojnu hromatografiju.
Postupak
Ekstrakcija i separacija
U posudu zapremine 250 ml odmeri se 25 g fino samlevenog uzorka, doda 100 ml smeše acetonitrila i vode (90 + 10) i 10 min mućka u snažnoj mućkalici. Ekstrakt se filtrira preko filtrir-papira. Za dalju analizu koristi se 25 ml filtrata koji se obezmašćuje u levku za odvajanje, dva puta sa po 25 ml heksana. Ostavi se da se slojevi odvoje i heksanska faza ukloni, a acetonitrilska faza se ekstrahuje sa novi 25 ml heksana i ponovo se odstrani heksanska faza. Zatim se doda 25 ml vode i 8 ml zasićenog rastvora NaHCO3 i ekstrahuje sa 25 ml hloroforma. Donji sloj se ispusti u drugi levak za odvajanje i ponovo ekstrahuje sa 25 ml hloroforma. Celokupna hloroformska faza čini ekstrakt l.
U levak za odvajanje, koji sadrži vodenu fazu, doda se 15 ml 1 mol (HCl)/l i ekstrahuje sa 20 ml hloroforma. Ekstrakcija kisele faze ponovi se sa još 20 ml hloroforma. Zatim se spojeni ekstrakt hloroforma filtrira kroz bezvodni Na2SO4 i koncentriše na 10 ml.
Koncentrisani ekstrakt prebaci se u malu staklenu posudu (zapremine oko 3 ml) uz hloroform i upari do suvog ostatka koji se otopi (ekstrakt 2) u 0,2 ml smeše benzol-acetonitrila (98 + 2) i ostavi za TLC.
U ekstrakt 1 doda se 10 ml 1 mol (NaOH)/L. Posle ekstrakcije ispusti se donji sloj u drugi levak za odvajanje i ekstrakcija ponovi sa istom količinom 1 mol (NaOH)/l. Pomešani ekstrakti natrijum-hidroksida su ekstrakti 1a.
Ekstrakt hloroforma ispere se sa 25 ml vode i donja faza se filtrira kroz bezvodni Na2SO4. Odvoji se vodena faza, hloroformski ekstrakt se prebaci u malu staklenu posudu i otopi u 0,2 ml rastvora benzol-acetonitrila (98 + 2) (ekstrakt 1b).
Ekstrakt 1a zakiseli se sa 8 ml 5 mol (1/3 H3PO4)/l i ekstrahuje dva puta sa 20 ml hloroforma. Sakupljeni ekstrakti hloroforma filtriraju se kroz bezvodni Na2SO4, upare i otope u 0,2 ml smeše benzol-acetonitrila (98 + 2) i ostave za TLC.
Tankoslojna hromatografija
Ekstrakti 1a. 1b i 2, u količini od 5 do 10 ml, nanesu se na ploče dimenzije 20 dž 20 cm prevučene slojem silikogela debljine 0,25 mm. Na iste ploče nanesu se i rastvori standarda mikotoksina, a zatim se ploče razvijaju u smeši rastvarača toluola, etilacetata i mravlje kiseline (50 + 40 + 10). Posle sušenja, mikotoksin se određuje upoređivanjem intenziteta fluorescencije mrlja uzorka i standarda.
U ekstraktu 1a nalazi se zearalenon, u ekstraktu 1b alfatoksin, a u ekstraktu 2 - ohratoksin.
Napomena. Po potrebi, mogu se sprovesti i testovi prskanjem 20%-nom sumpornom kiselinom u metanolu i zagrevanjem 15 min na temperaturi 120oC ili dvodimenzionalnom hromatografijom.
44. ODREĐIVANjE AKTIVNOSTI ANTIBIOTIKA MIKROBIOLOŠKIM METODAMA NA PETRIJEVIM ŠOLjAMA (METODA DIFUZIJE)
Princip
Aktivnost antibiotika određuju se metodom difuzije na agarnoj podlozi, inokuliranoj odgovarajućim mikroorganizmom. Radi se na Petrijevim šoljama, s tim da se rastvori uzorka i standarda stavljaju u dodir s inokuliranom podlogom posredstvom metalnih cilindara. Referentna koncentracija standardnog niza upoređuje se s rastvorom uzorka, a taj rastvor mora sadržavati približno istu koncentraciju antibiotika kao i standard. Standardni niz sastoji se iz četiri koncentracije koje se pripremaju serijskim razređivanjima takozvanog radnog rastvora standarda, s tim da je jedna koncentracija u standardnom nizu referentna koncentracija.
Sva četiri rastvora standardnog niza stavljaju se u cilindre na svaku od ukupno 10 Petrijevih šolja. Rastvor uzorka stavlja se u cilindre na pet ploča, uz referentnu koncentraciju standarda, i to: u dva cilindra stavi se rastvor uzorka, a u druga dva - rastvor standarda. Posle korekcije srednjih vrednosti prečnika zona inhibicija dobijenih pojedinim rastvorima standardnog niza, nacrta se baždarni dijagram i očita korigovana srednja vrednost prečnika zona inhibicija za referentnu koncentraciju standardnog niza. Ta vrednost služi za korekciju srednje vrednosti prečnika zona inhibicija dobijenih rastvorom uzorka. Koncentracija antibiotika u uzorku očita se iz baždarnog dijagrama.
Sastav hranljivih podloga za određivanje antibiotika:
1) oksitetraciklin (CHTC) i hloretraciklin (CHTC) pH vrednost posle sterilizacije = 5,6 - 5,7
pepton 6,0 g
ekstrakt kvasca 3,0 g
goveđi ekstrakt 1,5 g
agar 15,0 g
destilovana voda do 1000 ml
2) pepton 6,0 g
hidrolizovani kazein 4,0 g
ekstrakt kvasca 3,0 g
goveđi ekstrakt 1,5 g
dekstroza 1,0 g
agar 15,0 g
destilovana voda do 1000 ml
Posle sterilizacije, pH za oleandomicin, tilozin i neomicin iznosi 7,8 - 8,0, za benzatin-penicilin G 6,5 - 6,6, a za virginiamicin 7,4. Za bacitracin iznosi takođe 6,5 - 6,6.
Sastav hranljivih podloga za uzgoj test-mikroorganizma (PODLOGA A):
pepton 6,0 g
hidrolizat kazeina 4,0 g
ekstrakt kvasca 3,0 g
goveđi ekstrakt 1,5 g
dekstroza 1,0 g
agar 15,0 g
destilovana voda do 1000 ml; posle
sterilizacije, pH vrednost iznosi 6,5 - 6,6.
Puferi:
Koriste se sledeći puferi:
1) fosfatni pufer pH = 4,5: odmeri se 13,60 g KH2 PO4 u 1000 ml destilovane vode;
2) fosfatni pufer pH = 6: odmeri se 2,00 g K2 HPO4 i 8,00 g KH2 PO4 u 1000 ml destilovane vode;
3) fosfatni pufer pH = 8: odmeri se 16,73 g K2 HPO4 i 0,523 g KH2 PO4 u 1000 ml destilovane vode;
4) fosfatno-bikarbonatni pufer: pH = 8: odmeri se 16,73 g K2 HPO4, 0,523 g KH2 PO4 i 20,00 g NaCO3 u 1000 ml destilovane vode.
TEST-MIKROORGANIZMI ZA ODREĐIVANjE ANTIBIOTIKA
1) BACILLUS CEREUS var. mysaides ATCC 9634 NCTC 10320
Bacillus sereus var. mycoides presađuje se jedanput mesečno na kosi agar (podloga A).
Pripremanje koncentrisanog inokuluma: 24-časovna kultura gajena na kosom agaru (podloga A) pri temperaturi 37oC ispere se sa 5 ml sterilne destilovane vode, suspenzija prenese na Roudževu bocu u kojoj se nalazi 300 ml podloge A i podjednako rasporedi po površini pomoću staklenih kuglica. Inkubacija traje sedam dana na temperaturi 37oC. Klice se suspenduju u 30 ml sterilne destilovane vode, suspenzija se prenese u sterilnu bocu, drži 30 min na temperaturi 65oC i centrifugira. Ispiranje spora vrši se tri puta sa po 10 ml sterilne destilovane vode i svaki put sterilno centrifugira. Spore se zatim resuspenduju u 30 ml sterilne destilovane vode, još jedanput greju 30 min na temperaturi 65oC, suspenzija se ohladi, sterilno homogenizuje i centrifugira 5 min na 1500 o/m. Istaloženi deo spora se baci, a ostatak suspenzije upotrebljava se kao inokulum (ako se čuva na temperaturi + 4oC, traje jednu godinu). U prethodnim probama se utvrdi zapremina nerazrađenog ili razrađenog inokuluma koji treba dodati određenoj količini hranljive podloge da se s najmanjom koncentracijom antibiotika u standardnom nizu dobiju dovoljno velike i oštre zone inhibicije.
2) SARCINA LUTEA ATCC 9341
Sarcina lutea ATCC 9341 presađuje se jedanput mesečno na kosi agar (podloga A): 24-časovna kultura, gajena na kosom agaru, ispere se fiziološkim rastvorom (oko 3 ml). U prethodnim probama utvrdi se zapremina suspenzije inokuluma koji treba dodati određenoj količini hranljive podloge da se s najmanjom koncentracijom antibiotika u standardnom nizu dobiju dovoljno velike i oštre zone inhibicije. Sarcina lutea priprema se neposredno pred upotrebu. Taj mikroorganizam treba presaditi na kosi agar, isprati fiziološkim rastvorom, a zatim upotrebiti.
3) MICROCOSSUS PYOGENES VAR. AUREUS ATCC 6538 - P (Staphylococcus areus)
Micrococcus pyogenes var.aureus presađuje se dva puta mesečno na kosi agar (podloga A).
Pripremanje koncetrovanog inokuluma: 24-časovna kultura, gajena na kosom agaru (podloga A) na temperaturi 32oC, ispere se sa 3 ml fiziološkom rastvora, suspenzija se prenese u Roudžovu bocu, koja sadrži 300 ml podloge A i 24 h inkubira na 32oC, a posle toga još 24 h na sobnoj temperaturi. Narasla kultura ispere se s 50 ml fiziološkog rastvora. Upotrebljiva je šest meseci na temperaturi + 4oC.
4) MICROCOCCUS FLAVUS ATCC 10240 - A NCTC 7743
Micrococcus flavus ATCC 10240 - A NCTC presađuje se dva puta mesečno na kosi agar (podloga A): 24-časovna kultura, gajena na kosom agaru, ispere se fiziološkim rastvorom (oko 3 ml). U prethodnim probama se utvrdi zapremina suspenzije inokuluma koji treba dodati određenoj količini hranljive podloge da se s najmanjom koncentracijom antibiotika u standardnom nizu dobiju dovoljno velike i oštre zone inhibicije. Micrococcus flavus priprema se neposredno pred upotrebu, tj. taj mikroorganizam pre upotrebe treba presaditi na kosi agar, isprati fiziološkim rastvorom i zatim upotrebiti.
Aparatura i pribor
Osim uobičajene laboratorijske opreme, potrebne su i:
1) Petrijeve šolje (ploče), prečnika 100 mm (istih veličina i potpuno ravnog dna);
2) metalni cilindri izrađeni od nerđajućeg čelika, spoljnog prečnika 8 mm, unutrašnjeg prečnika 6 mm i visine 10 mm;
3) nivelisana ploča sa vijcima za regulaciju nagiba. Horizontalnost se proverava vodenom vagom;
4) graduisane pipete s ispusnim otvorom 3 do 4 mm za razlivanje podloge (podloga se mora otpipetirati u zdelice u roku od 2 do 3 sec);
5) šestar sa dva šiljka za merenje prečnika zona inhibicija. Merenje se vrši na milimetarskom papiru;
6) termostat;
7) mehanička električna mućkalica sa držačima za konične (erlenmajer) tikvice;
8) polulogaritamski papir za izradu baždarnog dijagrama.
Pripremanje Petrijevih šolja (ploča)
Petrijeve šolje sterilišu se na temperaturi 160oC. U prethodno zagrejane ploče (50oC) pipetira se po 5,5 ml inokulirane agarne podloge. Ploča se odmah stavi na nivelisanu podlogu, pokrije poklopcem i ohladi. Na takvu ploču stavljaju se metalni cilindri pomoću pincete, uz prikladnu šemu.
Pripremanje standardnih rastvora - standardni niz
Za izradu baždarnog dijagrama pomoću koga se izračunava koncentracija antibiotika u uzorku služi takozvani standardni niz - standardni rastvori četiri različite koncentracije, od kojih je jedan referentna koncentracija standarda. Standardni niz, odnosno četiri koncentracije standarda dobijaju se razređivanjem radnog rastvora standarda pomoću odgovarajućeg pufera ili posebno pripremljenog razređivača.
Pripremanje uzorka za analizu
Uzorak za analizu priprema se zavisno od vrste uzorka, kao i vrste i koncentracije antibiotika. Potrebno je voditi računa o tome da ekstrakt uzorka bude razređen na osnovu označene ili pretpostavljene koncentracije antibiotika u izvornom uzorku u odnosu na koncentraciju koja je jednaka ili slična referentnoj koncentraciji standardnog niza.
Postupak određivanja
Svaka koncentracija standardnog niza stavi se na svaku od ukupno 10 Petrijevih šolja sa inokuliranom agarnom podlogom, i to u metalne cilindre raspoređene u obliku krsta. Rastvor uzorka stavi se u dva cilindra koji leže jedan nasuprot drugome, na svaku od pet Petrijevih ploča, dok se u preostala dva cilindra istih šolja stavi referentna koncentracija standardnog niza. Posle inkubacije inokulirane agarne podloge (ploče se ostave u termostatu preko noći na temperaturi 30oC) dobije se 10 zona inhibicija za rastvor uzorka i 10 zona inhibicija za referentnu koncentraciju na istim pločama. Takođe se dobije 10 zona inhibicije za svaku od četiri koncentracije standardnog niza (10 ploča).
Baždarni dijagram i izračunavanje
Posle inkubacije izmere se prečnici zona inhibicija dobijenih s pojedinim rastvorima standardnog niza i s rastvorom uzorka, pa se izračunaju njihove srednje vrednosti:
A - srednja vrednost svih prečnika zona inhibicije dobijenih s najvećom koncentracijom u standardnom nizu;
B - srednja vrednost svih prečnika zona inhibicije dobijenih s referentnom koncentracijom standarda na pločama s uzorkom;
C - srednja vrednost svih prečnika zona inhibicije dobijenih s onom koncentracijom iz standardnog niza koja je dobijena razređivanjem najveće koncentracije u standardnom nizu u odnosu 1 + 3;
D - srednja vrednost svih prečnika zona inhibicija dobijenih s najmanjom koncentracijom u standardnom nizu (takva koncentracija dobijena je razređivanjem najveće koncentracije standardnog niza u odnosu 1 + 7.
Baždarni dijagram se radi pomoću dve brojčane vrednosti (dobijene iz eksperimentalnih podataka), i to:
H = (7A + 4B + C - 2D) / 10
: 51;0:gde je:
: 51;0:H - korigovana srednja vrednost prečnika zona inhibicija dobijenih s najvećom koncentracijom u standardnom nizu:
: 51;0:L = (7D + 4C + B - 2A) / 10
: 51;0:gde je:
: 51;0:L - korigovana srednja vrednost prečnika zona inhibicija dobijenih s najmanjom koncentracijom u standardnom nizu.
Na apscisu (linearna skala) polulogaritamskog papira nanesu se korigovane srednje vrednosti H i L, a na ordinatu (logaritamska skala) - koncentracije standarda koje pripadaju tim rastvorima. Kroz prečnik linija povuče se prava linija.
Aktivnost antibiotika u rastvoru uzorka jednaka je vrednosti ordinate one tačke na baždarnom pravcu čija je apscisa jednaka korigovanoj srednjoj vrednosti prečnika zona inhibicija dobijenih rastvorom uzorka:
Rkorigovano = R + (M - N)
gde je:
Rkorigovano - korigovana srednja vrednost prečnika zona inhibicija dobijenih rastvorom uzorka;
M - korigovana srednja vrednost prečnika zona inhibicije dobijenih s referentnom koncentracijom;
R - srednja vrednost svih prečnika zona inhibicija dobijenih s rastvorom uzorka (prema pretpostavci, mora sadržati istu količinu antibiotika kao i referentna koncentracija u standardnom nizu);
N - srednja vrednost svih prečnika zona inhibicija dobijenih s referentnom koncentracijom u standardnom nizu, na pločama na kojima se ona nalazi zajedno s rastvorom uzorka.
45. ODREĐIVANjE OKSITETRACIKLIN-HIDROHLORIDA (OTC HCl)
A) Stočna hrana koja sadrži više od 50 mg/kg OTC HCl
Reagensi i test-mikroorganizam:
1) fosfatni pufer pH = (u daljem tekstu pufer);
2) rastvor hlorovodonične kiseline, c(HCl) = 0,1 mol/l;
3) rastvor natrijum-hidroksida, c(NaOH) = 1 mol/l;
4) hranljiva agarna podloga, pH = 5,6 - 5,7;
5) test-mikroorganizam: Bacillus cerus var. mycoides ATCC 9634 NCTC 10 380;
6) standard OTC HCl: kao standardni rastvor služi baza OTC, empirijske formule C22H24N2O9 teoretske aktivnosti 1000 (mikro)g/mg, koji se topi u 0,1 mol/HCl/l.
Postupak
Na analitičkoj vagi odmeri se oko 5,0 g homogenizovanog uzorka, kvantitativno prenese u tikvicu za jodni broj, zapremine 250 ml i doda tačno 100 ml 0,1 mol (HCl)/l. Sadržina tikvice mućka se na mehaničkoj mućkalici 1 h. Ekstrakt se profiltrira preko suvog, nabranog filtrir-papira. Alikvotni deo filtrata razređuje se puferom do koncentracije OTC od 0,4 (mikro)g/1 ml, što odgovara referentnoj koncentraciji standarda. Filtrat se razređuje na osnovu pretpostavljene količine OTC u uzorku.
Standard
U odmernu tikvicu zapremine 50 ml odmeri se odgovarajuća količina OTC baze, otopi u 0,1 mol (HCl)/l i istim rastvorom dopuni do oznake. To je radni rastvor standarda, koji se može upotrebljavati mesec dana ko se čuva na temperaturi + 4oC. Svaki mililitar radnog rastvora standarda mora sadržati 1000 (mikro)g OTC baze. Daljim razređivanjima puferom pripremi se standardni niz, i to:
0,8 (mikro)g/ml;
0,4 (mikro)g/ml - referentna koncentracija;
0,2 (mikro)g/ml;
0,1 (mikro)g/ml;
Rastvori uzorka i standardnog niza pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče koje se inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracija OTC izračunava se prema opisanom postupku. S obzirom na to da je koncentracija antibiotika OTC izražena kao OTC baza, dobijenu vrednost treba pomnožiti faktorom 1,078 (donos teoretske aktivnosti OTC baze i OTC HCl). Tada je koncentracija izražena u obliku OTC HCl.
B) Stočna hrana koja sadrži manje od 50 mg/kg OTC HCl
Za određivanje malih količina OTC u stočnoj hrani, uz ostale reagense opisne u prethodnoj metodi, upotrebljava se i razređivač.
Pripremanje i uzorka
Na analitičkoj vagi odmeri se oko 10,0 g homogenizovanog uzorka, kvantitativno prenese u tikvicu za jodni broj, zapremine 250 ml i doda tačno 100 ml 0,1 mol (HCl)/l. Sadržina tikvice mućka se u mehaničkoj mućkalici 1 h i ekstrakt filtrira preko suvog, nabranog filtrir-papira. Tačno 20 ml ekstrakta otpipetira se u čašu zapremine 100 ml i pH vrednost rastvora podesi sa 1 mol (NaOH)/l na pH = 4,5. Zabeleži se utrošak baze i rastvoru doda toliko pufera da ukupna zapremina tečnosti u čašu bude 25 ml. Alikvotni deo ekstrakta razredi se puferom na koncentraciju od 0,4 (mikro)g/ml (razređuje se na osnovu pretpostavljene količine OTC u stočnoj hrani). Koncentracija od 0,2 (mikro)g/mg, što odgovara referentnoj koncentraciji u standardnom nizu, dobija se razređivanjem razređivačem.
Pripremanje razređivača
Odmeri se ista količina slepe probe (bez OTC) i uzorka koji se analizira i podvrgne istom postupku ekstrakcije i korigovanja pH vrednosti. Tako pripremljen ekstrakt slepe probe razredi se puferom u istom odnosu u kome je razređen analogno pripremljen ekstrakt originalnog uzorka prilikom razređivanja na koncentraciju od 0,4 (mikro)g/ml.
Standard
Na analitičkoj vagi odmeri se 10,0 g slepe probe u tikvici za jodni broj i doda toliko OTC baze da koncentracija bude jednaka pretpostavljenoj količini OTC u uzorku. Dalji postupak je isti kao i pri pripremanju uzorka. Najveća koncentracija u standardnom nizu, u ovom slučaju 0,4 (mikro)g/ml, razređivačem na koncentracije:
0,2 (mikro)g/ml - referentna koncentracija;
0,1 (mikro)g/ml;
0,05 (mikro)g/ml.
Rastvori uzorka i standarda pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče, koje se inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracija OTC izračunava se takođe prema opisanom postupku.
46. ODREĐIVANjE HLORTETRACIKLIN-HIDROHLORIDA (CHTC HCl)
A) Stočna hrana koja sadrži više od 50 mg/kg CTC HCl
Reagensi i test-mikroorganizam:
1) fosfatni pufer pH = 4,5 (u daljem tekstu: pufer);
2) aceton, r.a.;
3) koncetrovana hlorovodonična kiselina, HCl;
4) rastvor natrijum-hidroksida, c(NaOH) = 1 mol/l;
5) hranljiva agarna podloga, pH = 6,5 - 5,7;
6) test-mikroorganizam: Bacillus cerus var.mycoides ATCC 9633 NCTC 10380;
7) standard CHTC HCl: kao standard služi hlortetraciklin-hidrohlorid, empirijske formule C22H23N2O8Cl HCl, teoretske aktivnosti 1000 (mikro)g/mg, koji se topi u destilovanoj vodi.
Postupak
Na analitičkoj vagi odmeri se oko 5,0 g homogenizovanog uzorka, kvantitativno prenese u odmernu tikvicu zapremine 250 ml i doda tačno 100 ml kiselog rastvora acetona (650 ml acetona + 20 ml koncetrovane HCl + destilovane vode do 1000 ml). Sadržina tikvice mućka se 1 h na mehaničkoj mućkalici, a zatim rastvor dopuni do oznake fosfatnim puferom, izmeša se i profiltrira preko suvog, nabranog filtrir-papira. Alikvotni deo filtrata razređuje se puferom na koncentraciju CHTC HCl do 0,04 (mikro)g/ml, što odgovara referentnoj koncentraciji istog antibiotika u standardnom nizu. Alikvotni deo filtrata razređuje se na osnovu pretpostavljene količine CHTC HCl u uzorku.
Standard
U odmernu tikvicu zapremine 50 ml odmeri se odgovarajuća količina CHTC HCl standarda i rastvori u puferu, kojim se dopuni do oznake. To je radni rastvor standarda, koji u 1 ml mora sadržati 1000 (mikro)g CHTC HCl. Daljim razređivanjem radnog rastvora standarda puferom priprema se standardni niz, i to:
0,08 (mikro)g/ml;
0,04 (mikro)g/ml - referentna koncentracija;
0,02 (mikro)g/ml;
0,01 (mikro)g/ml.
Rastvori uzorka i standarda pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče, koje se inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracije CHTC HCl izračunavaju se takođe prema opisanom postupku.
B) Stočna hrana koje sadrži manje od 50 mg/kg CHTC HCl
Za određivanje malih količina oleandomicina u stočnoj hrani, uz ostale reagense opisane u prethodnoj metodi, upotrebljava se i razređivač.
Pripremanje uzorka
Na analitičkoj vagi odmeri se oko 10,0 g homogenizovanog uzorka, kvantitativno prenese u tikvicu za jodni broj zapremine 250 ml, i doda tačno 100 ml kiselog rastvora acetona (650 ml acetona, 20 ml koncetrovane HCl i destilovane vode do 1000 ml). Sadržina tikvice mućka se 1 h na mehaničkoj mućkalici a ekstrakt se filtrira preko suvog, nabranog filtrir-papira. Tačno 20 ml ekstrakta otpipetira se u čašu zapremine 100 ml i pH vrednost rastvora podesi na 4,5 pomoću 1 mol (NaOH)/l. Zabeleži se utrošak baze i rastvoru se doda toliko pufera da ukupna zapremina tečnosti u čašu bude 25 ml. Rastvor se filtrira i alikvotni deo razredi puferom na koncentraciju od 0,08 (mikro)g/ml (na osnovu pretpostavljene količine navedenog antibiotika u uzorku). Taj rastvor se dalje razredi razređivačem na koncentraciju CHTC HCl od 0,04 (mikro)g/ml, što odgovara referentnoj koncentraciji standardnog niza.
Pripremanje razređivača
Odmeri se ista količina slepe probe (bez antibiotika) i uzorka koji se analizira i podvrgne istom postupku ekstrakcije i korigovanja pH vrednosti. Tako pripremljen ekstrakt slepe probe razredi sa fosfatnim puferom u istom odnosu u kome je razređen analogno pripremljen ekstrakt originalnog uzorka prilikom razređivanja na koncentraciju od 0,08 (mikro)g/ml.
Standard
Odmeri se 10,0 g slepe probe (stočna hrana bez prisustva antibiotika) u tikvicu za jodni broj i doda toliko CHTC HCl standarda da koncentracija odgovara pretpostavljenoj količini CHTC HCl u uzorku. Dalji postupak je isti kao i pri pripremanju uzorka (ekstrakcije, podešavanje pH vrednosti itd). Rastvor koncentracije 0,08 (mikro)g CHTC HCl/ml (najveća koncentracija u standardnom nizu) razrađuje se razređivačem na koncentracije:
0,04 (mikro)g/ml - referentna koncentracija;
0,02 (mikro)g/ml;
0,01 (mikro)g/ml.
Rastvori uzorka i standarda pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče, koje se inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracija CHTC HCl u izvorima izračunava se takođe prema opisanom postupku.
47. ODREĐIVANjE OLEANDOMICINA
A) Stočna hrana koja sadrži više od 100 mg/kg oleandomicina
Reagensi i test-mikroorganizam:
1) fosfatno-bikarbonatni pufer, pH = 8 (u daljem tekstu:pufer);
2) hranljiva agarna podloga, pH = 7,8 -8,0;
3) metanol r.a.;
4) test-mikroorganizam: Sarcina lutea ATCC 9341;
5) standard oleandomicina: kao standard služi oleandomicin, empirijske formule C35H61NO12, teoretske aktivnosti 1000 (mikro)g/ml, topiv u metanolu.
Pripremanje uzorka
Na analitičkoj vagi odmeri se oko 5,0 g homogenizovanog uzorka, kvantitativno prenese u odmernu tikvicu zapremine 250 ml, doda se 150 ml pufera i 1 h mućka na mehaničkoj mućkalici. Rastvor se do oznake dopuni istim puferom, promeša i ekstrakt filtrira preko suvog, nabranog filtrir-papira. Alikvotni deo filtrata razređuje se puferom na koncentraciju 0,1 (mikro)g/ml, što odgovara referentnoj koncentraciji standarda, odnosno standardnog niza. Alikvotni deo filtrata razređuje se na osnovu pretpostavljene količine oleandomicina u uzorku.
Standard
U odmernu tikvicu zapremine 50 ml odmeri se odgovarajuća količina oleandomicin-standarda, rastvori u malo metanola i dobijeni rastvor razredi puferom i do oznake dopuni. To je radni standardni rastvor koji mora sadržati 1000 (mikro)g/ml oleandomicina. Daljim razređivanjima puferom pripremi se standardni niz, i to:
0,20 (mikro)g/ml;
0,10 (mikro)g/ml - referentna koncentracija;
0,04 (mikro)g/ml;
0,025 (mikro)g/ml.
Rastvori uzorka i standardnog niza pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče, koje se inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracija oleandomicina izračunava se takođe prema opisanom postupku.
B) Stočna hrana koja sadrži manje od 100 mg/kg oleandomicina
Za određivanje malih količina oleandomicina u stočnoj hrani, uz ostale reagense i standarde opisane u prethodnoj metodi, upotrebljava se i razređivač.
Pripremanje uzorka
Na analitičkoj vagi se odmeri oko 10,0 g homogenizovanog uzorka, kvantitativno prenese u tikvicu za jodni broj zapremine 250 ml i doda tačno 100 ml pufera. Sadržina tikvice mućka se 1 h na mehaničkoj mućkalici, a ekstrakt filtrira preko suvog, nabranog filtrir-papira. Alikvotni deo ekstrakta razredi se istim puferom na koncentraciju 0,20 (mikro)g oleandomicina/1 ml (razređuje se na osnovu pretpostavljene količine oleandomicina u uzorku). Taj rastvor se razredi razređivačem na koncentraciju od 0,1 (mikro)g oleandomicina/1 ml, što odgovara referentnoj koncentraciji standardnog niza.
Pripremanje razređivača
Na analitičkoj vagi odmeri se oko 10 g slepe probe (bez antibiotika) i prebaci u tikvicu za jodni broj, zapremine 250 ml, i podvrgne istom postupku kao i analizirani uzorak. Tako pripremljen ekstrakt slepe probe razredi se puferom u istom odnosu u kome je razređen analogno pripremljen ekstrakt uzorka prilikom razređivanja na koncentraciju 0,20 (mikro)g oleandomicina/1 ml.
Standard
Na analitičkoj vagi odmeri se 10,0 g slepe probe u tikvicu za jodni broj zapremine 250 ml i doda toliko standarda oleandomicina da koncentracija bude jednaka pretpostavljenoj količini oleandomicina u uzorku. Dalji postupak je isti kao i za pripremanje uzorka (ekstrakcija, filtriranje itd.). Koncentracija od 0,20 (mikro)g oleandomicina u 1 ml (najveća koncentracija oleandomicina u standardnom nizu) razređuje se razređivačem na koncentracije:
0,1 (mikro)g/1 ml - referentna koncentracija;
0,05 (mikro)g/1 ml;
0,025 (mikro)g/1 ml.
Rastvori uzorka i standarda pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče, koje se inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracija oleandomicina izračunava se takođe prema opisanom postupku.
48. ODREĐIVANjE BENZATIN-PENICILINA G
A) Stočna hrana koja sadrži više od 100 mg/kg benzatin-penicilina G
Reagensi i test-mikroorganizam:
1) fosfatni pufer pH = 6 (u daljem tekstu: pufer);
2) N,N' - dimetil-formamid, r.a.;
3) fiziološki rastvor;
4) hranljiva podloga, pH = 6,5 - 6,6;
5) test-mikroorganizam: Sarcina lutea ATCC 9341;
6) standard benzatin-penicilina G: kao standard služi benzatin-penicilin G, empirijske formule (C16H18N2O4S)2 . C16H20H2 . 4H2O, teoretske aktivnosti 1211 I.J./1 mg, topi se u N,N' - dimetil-formamidu.
Postupak
Na analitičkoj vagi odmeri se oko 5,0 g homogenizovanog uzorka, kvantitativno prenese u odmernu tikvicu zapremine 250 ml, doda se 100 ml N,N'dimetil-formamida i sadržina tikvice mućka 1 h mehaničkoj mućkalici. Volumen rastvora se dopuni zatim puferom do oznake, promeša i ekstrakt filtrira preko suvog, nabranog filtrir-papira. Alikvotni do ekstrakta razređuje se puferom na koncentraciju 0,4 (mikro)g benzatin-penicilina G/1 ml, što odgovara referentnoj koncentraciji istog antibiotika u standardnom nizu. Razređenje se izvodi na osnovu pretpostavljene količine benzatin-penicilina G u uzorku.
Standard
U odmernu tikvicu zapremine 50 ml odmeri se odgovarajuća količina benzatin-penicilin G standarda, rastvori u N,N' -dimetil-formamidu i zapremina dopuni istim rastvorom do oznake. To je radni rastvor standarda koji u 1 ml mora sadržati 1000 (mikro)g benzatin-penicilina. Daljim razređivanjima puferom pripremi se standardni niz, i to:
0,8 (mikro)g/ml;
0,4 (mikro)g/ml - referentna koncentracija;
0,2 (mikro)g/ml;
0,1 (mikro)g/ml.
Rastvori uzorka i standardnog niza pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče, koje se inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracija benzatin-penicilina G izračunava se takođe prema opisanom postupku.
B) Stočna hrana koja sadrži manje od 100 mg/kg benzatin-penicilina G
Za određivanje malih količina benzatin-penicilina G u stočnoj hrani, uz ostale reagense opisane u prethodnoj metodi, upotrebljava se i razređivač.
Pripremanje uzorka
Na analitičkoj vagi odmeri se oko 10,0 g homogenizovanog uzorka, kvantitativno prenese u tikvicu za jodni broj, zapremine 250 ml, i doda 100 N,N'-dimetil-formamida. Sadržina tikvice mućka se 1 h na mehaničkoj mućkalici, a ekstrakt filtrira preko suvog, nabranog filtrir-papira. Alikvotni deo ekstrakta razredi se puferom na koncentraciju 0,4 (mikro)g/ml (na osnovu pretpostavljene količine navedenog antibiotika u uzorku). Taj rastvor se razredi razređivačem na koncentraciju 0,2 (mikro)g/ml, što odgovara referentnoj koncentraciji standardnog niza.
Pripremanje razređivača
Odmeri se ista količina slepe probe (bez antibiotika) i uzorka koji se analizira i podvrgne istom postupku ekstrakcije kao i analizirani uzorak. Tako pripremljen ekstrakt slepe probe razredi se puferom u istom odnosu u kome je razređen analogno pripremljen ekstrakt uzorka prilikom razređivanja na koncentraciju 0,4 (mikro)g/ml benzatin-penicilina G.
Standard
Odmeri se 10,0 slepe g probe u tikvicu za jodni broj, zapremine 250 ml, i doda toliko benzatin-penicilina G standarda da koncentracija bude jednaka pretpostavljenoj količini benzatin-penicilina G u uzorku. Dalji postupak isti je kao i pri pripremanju uzorka. Koncentracija od 0,4 (mikro)g benzatin-penicilina G/1 ml (najveća koncentracija u standardnom nizu) razređuje se razređivačem na koncentracije:
0,20 (mikro)g/1 ml - referentna koncentracija;
0,10 (mikro)g/1 ml;
0,05 (mikro)g/1 ml.
Rastvori uzorka i standardnog niza pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče, koje se inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracija benzatin-penicilina G izračunava se takođe prema opisanom postupku.
49. ODREĐIVANjE CINK-BACITRACINA
A) Stočna hrana koja sadrži više od 50 mg/kg cink-bacitracina
Reagensi i test-mikroorganizam:
1) fosfatni pufer pH = 6 (u daljem tekstu: pufer);
2) hranljiva agarna podloga, pH = 6,5 - 6,6;
3) hlorovodonična kiselina, koncetrovana;
4) fiziološki rastvor za ispiranje test-mikroorganizma;
5) test-mikroorganizam: Microccocus flavus ATCC 10240-A NCTC ili Sarcina lutea ATCC 9341;
6) standard cink-bacitracina: kao standard služi cink-bacitracin, empirijske formule C66H103O16N17C (1 molekul sadrži 1-2 ekvivalenta cinka). Teoretska aktivnost cink-bacitracina je 56 I.J./1 mg. Standard se topi u zakiseljenim vodenim rastvorima, u kojima je pH vrednost manja od 5.
Postupak
Na analitičkoj vagi odmeri se oko 5,0 g homogenizovanog uzorka, kvantitativno prenese u tikvicu za jodni broj zapremine 20 ml i doda tačno 25 ml razređene hlorovodonične kiseline (1 zapreminski deo koncetrovane HCl + 2,5 zapreminskih delova destilovane vode) i sadržina mućka 1 h na mehaničkoj mućkalici. Posle toga ekstraktu se doda 75 ml pufera i promeša. Posle filtriranja preko suvog, nabranog, filtrir-papira alikvotni deo ekstrakta se razredi na 0,1 (mikro)g cink-bacitracina/1 ml, što odgovara referentnoj koncentraciji u standardnom nizu. Alikvotni deo ekstrakta se razređuje na osnovu pretpostavljene količine cink-bacitracina u uzorku.
Standard
U odmernu tikvicu zapremine 50 ml odmeri se potrebna količina standarda cink-bacitracina, rastvori se u razređenoj hlorovodoničnoj kiselini (1 zapreminski deo koncetrovane HCl + 2,5 zapreminskih delova destilovane vode) i puferom dopuni do oznake. To je radni rastvor standarda, koji mora sadržati 1000 (mikro)g cink-bacitracina/1 ml. Daljim razređivanjima puferom pripremi se standardni niz, i to:
0,20 (mikro)g/1 ml;
0,10 (mikro)g/1 ml - referentna koncentracija;
0,05 (mikro)g/1 ml;
0,25 (mikro)g/1 ml.
Rastvori uzorka i standarda pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče, koje se inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracija cink-bacitracina izračunava se takođe prema opisanom postupku.
B) Stočna hrana koja sadrži manje od 50 mg/kg cink-bacitracina
Za određivanje malih količina cink-bacitracina u stočnoj grani, uz ostale reagense opisane u prethodnoj metodi, upotrebljava se i razređivač.
Pripremanje uzorka
Na analitičkoj vagi odmeri se oko 10,0 g homogenizovanog uzorka, kvantitativno prenese u tikvicu za jodni broj, zapremine 250 ml i doda 25 ml razređene HCl (1 zapreminski deo koncetrovane HCl + 2,5 zapreminskih delova destilovane vode). Standardna tikvica mućka se 1 h na mehaničkoj mućkalici. Posle toga, ekstraktu se doda tačno 75 ml pufera i promeša. Posle filtriranja ekstrakta preko suvog, nabranog filtrir-papira, alikvotni deo ekstrakta se razredi na koncentraciju cink-bacitracina od 0,2 (mikro)g/1 ml (na osnovu pretpostavljene količine cink-bacitracina u uzorku). Taj se rastvor razredi pomoću razređivača na koncentraciji od 0,1 (mikro)g cink-bacitracina/1 ml, što odgovara njegovoj referentnoj koncentraciji u standardnom nizu.
Pripremanje razređivača
Odmeri se oko 10,0 g slepe probe (bez cink-bacitracina) u tikvicu za jodni broj, zapremine 250 ml i podvrgne istom postupku kao i analizirani uzorak. Tako pripremljen ekstrakt slepe probe razredi se puferom u istom odnosu u kome je razređen analogno pripremljen ekstrakt uzorka prilikom razređivanja na koncentraciju 0,2 (mikro)g cink-bacitracina/1 ml.
Standard
Odmeri se 10,0 g slepe probe (bez antibiotika) u tikvicu za jodni broj, zapremine 250 ml, i doda toliko standarda cink-bacitracina da koncentracija bude jednaka pretpostavljenoj količini cink-bacitracina u uzorku. Dalji postupak je isti kao i pri pripremanju uzorka. Koncentracija od 0,20 (mikro)g/1 ml (najveća koncentracija u standardnom nizu) razređuje se razređivačem na koncentracije:
0,10 (mikro)g/1 ml - referentna koncentracija;
0,05 (mikro)g/1 ml;
0,025 (mikro)g/1 ml.
Rastvori uzorka i standarda pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče, koje se inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracija cink-bacitracina izračunava se takođe prema opisanom postupku.
50. ODREĐIVANjE TILOZINA
A) Stočna hrana koja sadrži više od 100 mg/kg tilozina
Reagensi i test mikroorganizam:
1) fosfatni pufer, pH = 8 (u daljem tekstu: pufer);
2) hranljiva agarna podloga, pH = 7,8 - 8,0;
3) metanol, r.a.;
4) test-mikroorganizam: Sarcina lutea ATCC 9341;
5) standard tilozina: kao standard služi tilozin-baza, teoretske aktivnosti 1050 (mikro)g/mg, koja se topi u metanolu.
Postupak
Na analitičkoj vagi se odmeri oko 5,0 g homogenizovanog uzorka, prenese kvantitativno u odmernu tikvicu zapremine 250 ml, doda 25 ml pufera i 75 ml mešavine metanola i pufera u odnosu 8 : 7. Sadržina tikvice mućka se 1 h, na mehaničkoj mućkalici, a zapremina u tikvici dopuni do oznake mešavinom metanola i pufera u odnosu 4 : 6. Dobijeni ekstrakt filtrira se kroz suvi, nabrani filtrir-papir i razređuje mešavinom metanola i pufera (4 + 6) na koncentraciju 0,50 (mikro)g tilozina/1 ml (razređuje se na osnovu pretpostavljene količine tilozina u uzorku). Koncentracija od 0,50 (mikro)g tilozina/1 ml odgovara referentnoj koncentraciji iz standardnog niza.
Standard
U odmernu tikvicu zapremine 50 ml odmeri se odgovarajuća količina standarda tilozina, rastvori se u malo metanola i dobijeni rastvor razredi do oznake mešavinom metanola i pufera ( 4 + 6). To je radni rastvor standarda, koji u 1 ml mora sadržati 1000 (mikro)g tilozina. Daljim razređivanjima istom mešavinom pripremi se standardni niz, i to:
1,00 (mikro)g/1 ml;
0,50 (mikro)g/1 ml - referentna koncentracija;
0,250 (mikro)g/1 ml;
0,125 (mikro)g/1 ml.
Rastvori uzorka i standarda pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče, koje se inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracija tilozina izračunava se takođe prema priloženom postupku.
B) Stočna hrana koja sadrži manje od 100 mg/kg tilozina
Za određivanje malih količina tilozina u stočnoj hrani, uz ostale reagense opisane u prethodnoj metodi, upotrebljava se i razređivač.
Pripremanje uzorka
Na analitičkoj vagi odmeri se oko 10,0 g homogenizovanog uzorka, kvantitativno prenese u tikvicu za jodni broj, zapremine 250 ml i doda 25 ml pufera i 75 ml mešavine metanola i pufera (8 + 7). Sadržina tikvice se mućka 1 h na mehaničkoj mućkalici, ekstrakt dekantuje u odmernu tikvicu zapremine 250 ml, a ostatak u tikvici ekstrahuje se još jedanput pola sata mešavinom metanola i pufera (4 + 6). Taj drugi ekstrakt dekantuje se u istu odmernu tikvicu, talog se dva do tri puta ispere istim rastvaračem, posle čega se zapremina dopuni do oznake. Dobijeni ekstrakt profiltrira se preko suvog, nabranog filtrir-papira i alikvotni deo razredi mešavinom rastvarača metanola i pufera (4 + 6), na koncentraciju tilozina od 1 (mikro)g/1 ml (razređuje se na osnovu pretpostavljene količine tilozina u uzorku). Taj rastvor se razredi razređivačem na koncentraciju od 0,50 (mikro)g/1 ml, što odgovara referentnoj koncentraciji u standardnom nizu.
Pripremanje razređivača
Odmeri se oko 10,0 g slepe probe (bez antibiotika) u tikvicu za jodni broj, zapremine 250 ml, i podvrgne istom postupku kao i analizirani uzorak. Tako pripremljen ekstrakt slepe probe razredi se mešavinom metanola i pufera ( 4 + 6), u istom odnosu u kome je razređen analogno pripremljen ekstrakt uzorka prilikom razređivanja na koncentraciju 1 (mikro)g tilozina/ 1 ml.
Standard
Odmeri se oko 10,0 g slepe probe u tikvicu za jodni broj, zapremine 250 ml, i doda toliko standarda tilozina da koncentracija bude jednaka pretpostavljenoj količini tilozina u uzorku. Dalji postupak isti je kao i pri pripremanju uzorka (ekstrakcija, filtriranje itd). Koncentracija od 1 (mikro)g tilozina/1 ml (najveća koncentracija u standardnom nizu) razređuje se razređivačem na koncentracije:
0,50 (mikro)g/1 ml - referentna koncentracija;
0,25 (mikro)g/1 ml;
0,125 (mikro)g/1 ml.
Rastvori uzorka i standarda pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče i inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracija tilozina takođe se izračunava prema opisanom postupku.
51. ODREĐIVANjE NEOMICINA
A) Stočna hrana koja sadrži više od 100 mg/kg neomicina
Reagensi i test-mikroorganizam:
Za određivanje koriste se sledeći reagensi:
1) fosfatni pufer, pH = 8 (u daljem tekstu: pufer);
2) hranljiva agarna podloga, pH = 7,8 - 8,0;
3) fiziološki rastvor;
4) test-mikroorganizam: Micrococcus pyogenes var. aureus ATCC 6538-P;
5) standard-neomicina: kao standard služi neomicin, empirijske formule C23H46N6O18, teoretske aktivnosti 1000 (mikro)g/mg, koji se topi u destilovanoj vodi.
Postupak
Na analitičkoj vagi odmeri se oko 5,0 homogenizovanog uzorka, kvantitativno prenese u odmernu tikvicu zapremine 250 ml, doda se 100 ml pufera i sadržina tikvice mućka 1 h na mehaničkoj mućkalici. Ekstrakt se profiltrira preko suvog, nabranog filtrir-papira. Alikvotni deo ekstrakta rezredi se puferom na koncentraciju od 1 (mikro)g neomicina/1 ml (razređuje se na osnovu pretpostavljene količine neomicina u uzorku). Koncentracija od 1 (mikro)g neomicina na 1 ml odgovara referentnoj koncentraciji iz standardnog niza.
Standard
U odmernu tikvicu zapremine 50 ml odmeri se potrebna količina standarda neomicina, rastvori se u malo destilovane vode i dobijena rastvor puferom razredi do oznake. To je radni rastvor standarda koji u 1 ml sadrži 1000 (mikro)g neomicina. Daljim razređivanjima istim puferom pripremi se standardni niz, i to:
2,00 (mikro)g/1 ml;
1,00 (mikro)g/1 ml - referentna koncentracija;
0,50 (mikro)g/1 ml;
0,25 (mikro)g/1 ml.
Rastvori uzorka i standardnog niza pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče, koje se inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracija neomicina izračunava se takođe prema opisanom postupku.
B) Stočna hrana koja sadrži manje od 100 mg/kg neomicina
Za određivanje malih količina neomicina u stočnoj hrani, uz ostale reagense upotrebljava se i razređivač.
Pripremanje uzorka
Odmeri se oko 10,0 g homogenizovanog uzorka, kvantitativno prenese u tikvicu za jodni broj, zapremine 250 ml i doda 100 ml pufera. Sadržina tikvice mućka se 1 h na mehaničkoj mućkalici. Dobijeni ekstrakt profiltrira se preko suvog, nabranog filtrir-papira, alikvotni deo razredi se istim puferom na koncentraciju 2,0 (mikro)g neomicina/1 ml (razređuje se na bazi pretpostavljene količine neomicina u uzorku). Taj rastvor se razredi razređivačem na koncentraciju 1 g neomicina na 1 ml, što odgovara referentnoj koncentraciji standardnog niza.
Pripremanje razređivača
Odmeri se oko 10,0 g slepe probe (bez antibiotika) u tikvicu za jodni broj zapremine 250 ml i podvrgne istom postupku kao i analizirani uzorak. Tako pripremljen ekstrakt slepe probe razredi se puferom u istom odnosu u kome je razređen analogno pripremljen ekstrakt uzorka prilikom razređivanja na koncentraciju 2,00 (mikro)g baze-neomicina/1 ml.
Standard
Odmeri se 10,0 g slepe probe u tikvicu za jodni broj, zapremine 250 ml i doda toliko standarda neomicina da koncentracija bude jednaka pretpostavljenoj količini neomicina u uzorku. Dalji postupak je isti kao i pri pripremanju uzorka (ekstrakcija, filtriranje itd.). Koncentracija od 2,00 (mikro)g neomicina/1 ml (najveća koncentracija neomicina u standardnom nizu) razređuje se razređivačem na koncentracije:
1,00 (mikro)g/1 ml - referentna koncentracija;
0,50 (mikro)g/1 ml;
0,025 (mikro)g/1 ml.
Rastvori uzorka i standarda pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče, koje se inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracija neomicina izračunava se takođe prema opisanom postupku.
52. ODREĐIVANjE VIRGINIAMICINA
a) Stočna hrana koja sadrži više od 50 mg/kg virginiamicina
Reagensi i test-mikroorganizam:
1) metanol, r.a.;
2) hranljiva agarna podloga, pH = 7,4;
3) test-mikroorganizam: Sarcina lutea ATCC 9341;
4) standard virginiamicina: kao standard služi radni standard virginiamicina, teoretske aktivnosti 1900 I.J./1 mg, koji se tope u metanolu.
Pripremanje uzorka
Na analitičkoj vagi odmeri se oko 5,0 g homogenizovanog uzorka, kvantitativno prenese u odmernu tikvicu zapremine 250 ml, doda se 60 ml metanola i mućka 1 h na mehaničkoj mućkalici. Zapremina rastvora dopuni se do oznake destilovanom vodom i ekstrakt filtrira preko nabranog, suvog filtrir-papira. Alikvotni deo filtrata razređuje se vodom na koncentraciju 2,0 (mikro)g virginiamicina/1 ml, što odgovara referentnoj koncentraciji u standardnom nizu. Alikvotni deo filtrata razređuje se na osnovu pretpostavljene količine virginiamicina u uzorku.
Standard
U odmernu tikvicu zapremine 50 ml odmeri se potrebna količina standarda virginiamicina, rastvori u malo metanola i dobijeni rastvor razredi do oznake destilovanom vodom. To je radni rastvor standarda, koji u 1 ml mora sadržati 1000 (mikro)g virginiamicina. Daljim razređivanjima destilovanom vodom pripremi se standardni niz, i to:
4,00 (mikro)g/1 ml;
2,00 (mikro)g/1 ml - referentna koncentracija;
2,00 (mikro)g/1 ml;
0,50 (mikro)g/1 ml.
Rastvori uzorka i standarda pripremljeni na taj način stavljaju se na Petrijeve ploče, koje se inkubiraju prema opisanom postupku. Koncentracija virginiamicina izračunava se takođe prema opisanom postupku.
-------------------
NAPOMENA REDAKCIJE:
Slike 1 do 5 su izostavljene u DOS verziji CODE PROPISA.